Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Το Toxoplasma gondii είναι ένα ενδοκυτταρικό πρωτόζωο παράσιτο που ρυθμίζει το μικροπεριβάλλον του μολυσμένου ξενιστή και είναι γνωστό ότι σχετίζεται με τη συχνότητα ανάπτυξης όγκου εγκεφάλου.Σε αυτή τη μελέτη, υποθέτουμε ότι το εξωσωματικό miRNA-21 από τη μόλυνση από τοξόπλασμα προάγει την ανάπτυξη του όγκου του εγκεφάλου.Χαρακτηρίστηκαν εξωσώματα από μολυσμένα με τοξόπλασμα μικρογλοία BV2 και επιβεβαιώθηκε η εσωτερίκευση των κυττάρων γλοιώματος U87.Τα προφίλ έκφρασης του εξωσωματικού microRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συστοιχίες microRNA και microRNA-21A-5p που σχετίζονται με Toxoplasma gondii και ταξινόμηση όγκων.Ερευνήσαμε επίσης τα επίπεδα mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με όγκο σε κύτταρα γλοιώματος U87 αλλάζοντας τα επίπεδα miR-21 στα εξωσώματα και την επίδραση των εξωσωμάτων στον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων γλοιώματος U87.Σε εξωσώματα κυττάρων γλοιώματος U87 που έχουν μολυνθεί με Toxoplasma gondii, η έκφραση του microRNA-21 αυξάνεται και η δραστηριότητα των αντικαρκινικών γονιδίων (FoxO1, PTEN και PDCD4) μειώνεται.Τα προερχόμενα από BV2 εξωσώματα που έχουν μολυνθεί με τοξόπλασμα προκαλούν πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιώματος U87.Τα εξωσώματα επάγουν την ανάπτυξη των κυττάρων U87 σε ένα μοντέλο όγκου ποντικού.Προτείνουμε ότι το αυξημένο εξωσωματικό miR-21 σε μολυσμένα με τοξόπλασμα μικρογλοία BV2 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο ως προαγωγέας κυτταρικής ανάπτυξης στα κύτταρα γλοιώματος U87 μειώνοντας τα αντικαρκινικά γονίδια.
Υπολογίζεται ότι περισσότερες από 18,1 εκατομμύρια περιπτώσεις προχωρημένου καρκίνου διαγνώστηκαν παγκοσμίως το 2018, με περίπου 297.000 όγκους του κεντρικού νευρικού συστήματος να διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο (1,6% όλων των όγκων)1.Προηγούμενη έρευνα έχει δείξει ότι οι παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη όγκων του ανθρώπινου εγκεφάλου περιλαμβάνουν διάφορα χημικά προϊόντα, οικογενειακό ιστορικό και ιονίζουσα ακτινοβολία από κεφαλοθεραπευτικό και διαγνωστικό εξοπλισμό.Ωστόσο, η ακριβής αιτία αυτών των κακοηθειών είναι άγνωστη.Περίπου το 20% όλων των καρκίνων παγκοσμίως προκαλούνται από μολυσματικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων ιών, βακτηρίων και παρασίτων3,4.Τα μολυσματικά παθογόνα διαταράσσουν τους γενετικούς μηχανισμούς του κυττάρου-ξενιστή, όπως η επισκευή του DNA και ο κυτταρικός κύκλος, και μπορεί να οδηγήσουν σε χρόνια φλεγμονή και βλάβη στο ανοσοποιητικό σύστημα5.
Οι μολυσματικοί παράγοντες που σχετίζονται με τον ανθρώπινο καρκίνο είναι τα πιο κοινά ιικά παθογόνα, συμπεριλαμβανομένων των ιών των ανθρώπινων θηλωμάτων και των ιών της ηπατίτιδας Β και C.Τα παράσιτα μπορούν επίσης να παίξουν πιθανό ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου.Αρκετά είδη παρασίτων, συγκεκριμένα τα Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis και Hymenolepis nana, έχουν εμπλακεί σε διάφορους τύπους ανθρώπινου καρκίνου 6,7,8.
Το Toxoplasma gondii είναι ένα ενδοκυτταρικό πρωτόζωο που ρυθμίζει το μικροπεριβάλλον των μολυσμένων κυττάρων-ξενιστών.Αυτό το παράσιτο εκτιμάται ότι μολύνει περίπου το 30% του παγκόσμιου πληθυσμού, θέτοντας ολόκληρο τον πληθυσμό σε κίνδυνο9,10.Το Toxoplasma gondii μπορεί να μολύνει ζωτικά όργανα, συμπεριλαμβανομένου του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ), και να προκαλέσει σοβαρές ασθένειες όπως θανατηφόρα μηνιγγίτιδα και εγκεφαλίτιδα, ειδικά σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς9.Ωστόσο, το Toxoplasma gondii μπορεί επίσης να αλλάξει το περιβάλλον του μολυσμένου ξενιστή ρυθμίζοντας την κυτταρική ανάπτυξη και τις ανοσολογικές αποκρίσεις σε ανοσοεπαρκή άτομα, οδηγώντας στη διατήρηση μιας ασυμπτωματικής χρόνιας λοίμωξης9,11.Είναι ενδιαφέρον ότι, δεδομένης της συσχέτισης μεταξύ του επιπολασμού του T. gondii και της επίπτωσης του όγκου του εγκεφάλου, ορισμένες αναφορές υποδηλώνουν ότι οι in vivo περιβαλλοντικές αλλαγές του ξενιστή λόγω της χρόνιας μόλυνσης από T. gondii μοιάζουν με το μικροπεριβάλλον του όγκου.
Τα εξωσώματα είναι γνωστά ως διακυτταρικοί φορείς επικοινωνίας που παρέχουν βιολογικό περιεχόμενο, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, από γειτονικά κύτταρα16,17.Τα εξωσώματα μπορούν να επηρεάσουν τις βιολογικές διεργασίες που σχετίζονται με τον όγκο, όπως η αντι-απόπτωση, η αγγειογένεση και η μετάσταση στο μικροπεριβάλλον του όγκου.Συγκεκριμένα, τα miRNAs (miRNAs), μικρά μη κωδικοποιητικά RNA μήκους περίπου 22 νουκλεοτιδίων, είναι σημαντικοί ρυθμιστές γονιδίων μετά τη μεταγραφή που ελέγχουν περισσότερο από το 30% του ανθρώπινου mRNA μέσω του συμπλέγματος σιγής που προκαλείται από miRNA (miRISC).Το Toxoplasma gondii μπορεί να διαταράξει τις βιολογικές διεργασίες ελέγχοντας την έκφραση του miRNA σε μολυσμένους ξενιστές.Τα miRNA του ξενιστή περιέχουν σημαντικά σήματα για τη ρύθμιση των βιολογικών διεργασιών του ξενιστή για την επίτευξη της στρατηγικής επιβίωσης του παρασίτου.Έτσι, η μελέτη των αλλαγών στο προφίλ του miRNA του ξενιστή κατά τη μόλυνση με T. gondii μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ του ξενιστή και του T. gondii πιο καθαρά.Πράγματι, οι Thirugnanam et al.15 πρότειναν ότι το T. gondii προάγει την καρκινογένεση του εγκεφάλου αλλάζοντας την έκφρασή του σε συγκεκριμένα miRNAs του ξενιστή που σχετίζονται με την ανάπτυξη όγκου και διαπίστωσαν ότι το T. gondii μπορεί να προκαλέσει γλοιώματα σε πειραματόζωα.
Αυτή η μελέτη επικεντρώνεται στην αλλοίωση του εξωσωματικού miR-21 σε μικρογλοία ξενιστή που έχει μολυνθεί με τοξόπλασμα BV2.Παρατηρήσαμε έναν πιθανό ρόλο του αλλοιωμένου εξωσωματικού miR-21 στην ανάπτυξη των κυττάρων γλοιώματος U87 λόγω της κατακράτησης στον πυρήνα του FoxO1/p27, ο οποίος είναι ο στόχος του υπερεκφρασμένου miR-21.
Τα εξωσώματα που προέρχονται από το BV2 ελήφθησαν χρησιμοποιώντας διαφορική φυγοκέντρηση και επικυρώθηκαν με διάφορες μεθόδους για την πρόληψη της μόλυνσης με κυτταρικά συστατικά ή άλλα κυστίδια.Η ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) έδειξε διακριτά μοτίβα μεταξύ πρωτεϊνών που εκχυλίστηκαν από κύτταρα BV2 και εξωσώματα (Εικόνα 1Α) και τα δείγματα αξιολογήθηκαν για την παρουσία Alix, η οποία αναλύθηκε με στύπωμα Western των δεικτών εξωσωματικής πρωτεΐνης στο .Η επισήμανση Alix βρέθηκε σε πρωτεΐνες εξωσώματος αλλά όχι σε πρωτεΐνες λύματος κυττάρων BV2 (Εικ. 1Β).Επιπλέον, καθαρισμένο RNA από εξωσώματα που προέρχονται από BV2 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας έναν βιοαναλυτή.Οι ριβοσωματικές υπομονάδες 18S και 28S σπάνια παρατηρήθηκαν στο πρότυπο μετανάστευσης του εξωσωματικού RNA, υποδεικνύοντας αξιόπιστη καθαρότητα (Εικόνα 1C).Τέλος, το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης έδειξε ότι τα παρατηρούμενα εξωσώματα είχαν μέγεθος περίπου 60-150 nm και είχαν δομή τύπου κυπέλλου χαρακτηριστική της μορφολογίας των εξωσωμάτων (Εικ. 1D).
Χαρακτηρισμός εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα BV2.(Α) Σελίδα δελτίου δεδομένων ασφαλείας.Πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κύτταρα BV2 ή εξωσώματα που προέρχονται από BV2.Τα πρωτεϊνικά μοτίβα διαφέρουν μεταξύ κυττάρων και εξωσωμάτων.(Β) Ανάλυση στυπώματος Western ενός εξωσωματικού δείκτη (Alix).(Γ) Αξιολόγηση καθαρισμένου RNA από κύτταρα BV2 και εξωσώματα που προέρχονται από BV2 χρησιμοποιώντας βιοαναλυτή.Έτσι, οι ριβοσωμικές υπομονάδες 18S και 28S σε κύτταρα BV2 βρέθηκαν σπάνια στο εξωσωματικό RNA.(Δ) Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης έδειξε ότι τα εξωσώματα που απομονώθηκαν από κύτταρα BV2 χρωματίστηκαν αρνητικά με 2% οξικό ουρανύλιο.Τα εξωσώματα έχουν μέγεθος περίπου 60-150 nm και σχήμα κυπέλλου (Song and Jung, αδημοσίευτα δεδομένα).
Η κυτταρική εσωτερίκευση των εξωσωμάτων που προέρχονται από το BV2 σε κύτταρα ανθρώπινου γλοιώματος U87 παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία.Τα επισημασμένα με PKH26 εξωσώματα εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων U87.Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (Εικ. 2Α), υποδεικνύοντας ότι τα εξωσώματα που προέρχονται από BV2 μπορούν να εσωτερικευτούν από τα κύτταρα-ξενιστές και να επηρεάσουν το περιβάλλον των κυττάρων-δεκτών.
Η εσωτερίκευση εξωσωμάτων που προέρχονται από BV2 σε κύτταρα γλοιώματος U87 και εξωσώματα προερχόμενα από BV2 μολυσμένα με Toxoplasma RH προκάλεσε πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιώματος U87.(Α) Εξωσώματα που κατακλύζονται από κύτταρα U87 μετρημένα με ομοεστιακή μικροσκοπία.Τα κύτταρα γλοιώματος U87 επωάστηκαν με εξωσώματα σημασμένα με PKH26 (κόκκινο) ή χωρίς έλεγχο για 24 ώρες.Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (μπλε) και στη συνέχεια παρατηρήθηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο (γραμμή κλίμακας: 10 μm, x 3000).(Β) Ο πολλαπλασιασμός κυττάρων γλοιώματος U87 προσδιορίστηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων.Τα κύτταρα γλοιώματος U87 υποβλήθηκαν σε αγωγή με εξωσώματα για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. *Ρ < 0,05 λήφθηκε με τη δοκιμή t Student. *Ρ < 0,05 λήφθηκε με τη δοκιμή t Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 από Student's t-test. *P <0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 που λήφθηκε με χρήση του Student's t-test.
Αφού επιβεβαιώσαμε την εσωτερίκευση των εξωσωμάτων που προέρχονται από BV2 σε κύτταρα γλοιώματος U87, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού για να διερευνήσουμε τον ρόλο των εξωσωμάτων που προέρχονται από το τοξόπλασμα που προέρχονται από BV2 στην ανάπτυξη ανθρώπινων κυττάρων γλοιώματος.Η επεξεργασία των κυττάρων U87 με εξωσώματα από κύτταρα BV2 μολυσμένα με T. gondii έδειξε ότι τα μολυσμένα με T. gondii εξωσώματα που προέρχονται από BV2 προκάλεσαν σημαντικά υψηλότερο πολλαπλασιασμό των κυττάρων U87 σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 2Β).
Επιπλέον, η ανάπτυξη των κυττάρων U118 είχε τα ίδια αποτελέσματα με το U87, καθώς τα διεγερμένα από το τοξόπλασμα εξωσώματα προκάλεσαν τα υψηλότερα επίπεδα πολλαπλασιασμού (τα δεδομένα δεν φαίνονται).Με βάση αυτά τα δεδομένα, μπορούμε να υποδείξουμε ότι τα μολυσμένα από τοξόπλασμα εξωσώματα που προέρχονται από το BV2 παίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του γλοιώματος.
Για να διερευνήσουμε την επίδραση των μολυσμένων από τοξόπλασμα εξωσωμάτων που προέρχονται από BV2 στην ανάπτυξη όγκου, εγχύαμε κύτταρα γλοιώματος U87 σε γυμνά ποντίκια για ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος και εγχύαμε εξωσώματα προερχόμενα από BV2 ή εξωσώματα προερχόμενα από BV2 μολυσμένα με RH.Αφού οι όγκοι έγιναν εμφανείς μετά από 1 εβδομάδα, κάθε πειραματική ομάδα 5 ποντικών χωρίστηκε ανάλογα με το μέγεθος του όγκου για να προσδιοριστεί το ίδιο σημείο εκκίνησης και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε για 22 ημέρες.
Σε ποντίκια με το μοντέλο ξενομοσχεύματος U87, σημαντικά μεγαλύτερο μέγεθος και βάρος όγκου παρατηρήθηκαν στην ομάδα εξωσώματος που προέρχεται από RH που προέρχεται από RH την ημέρα 22 (Εικ. 3Α, Β).Από την άλλη πλευρά, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέγεθος του όγκου μεταξύ της ομάδας εξωσώματος που προέρχεται από BV2 και της ομάδας ελέγχου μετά τη θεραπεία με εξωσώματα.Επιπλέον, τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση με κύτταρα γλοιώματος και εξωσώματα εμφάνισαν οπτικά τον μεγαλύτερο όγκο όγκου στην ομάδα εξωσωμάτων που προέρχονται από BV2 μολυσμένα με RH (Εικ. 3C).Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι τα μολυσμένα με τοξόπλασμα εξωσώματα που προέρχονται από BV2 προκαλούν ανάπτυξη γλοιώματος σε μοντέλο όγκου ποντικού.
Ογκογένεση (AC) εξωσωμάτων που προέρχονται από BV2 σε μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος U87.Το μέγεθος του όγκου (Α) και το βάρος (Β) αυξήθηκαν σημαντικά σε γυμνά ποντίκια BALB/c που έλαβαν θεραπεία με εξωσώματα μολυσμένα με RH που προέρχονται από BV2.BALB/c γυμνά ποντίκια (C) ενέθηκαν υποδορίως με 1 χ 107 U87 κύτταρα εναιωρημένα σε μίγμα Matrigel.Έξι ημέρες μετά την ένεση, 100 μg εξωσωμάτων που προέρχονται από BV2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία σε ποντίκια.Το μέγεθος και το βάρος του όγκου μετρήθηκαν τις υποδεικνυόμενες ημέρες και μετά τη θανάτωση, αντίστοιχα. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Τα δεδομένα έδειξαν ότι 37 miRNAs (16 υπερεκφρασμένα και 21 μειωμένα) που σχετίζονται με την ανοσία ή την ανάπτυξη όγκου άλλαξαν σημαντικά στη μικρογλοία μετά από μόλυνση με το στέλεχος Toxoplasma RH (Εικ. 4Α).Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-21 μεταξύ των αλλαγμένων miRNA επιβεβαιώθηκαν με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο σε εξωσώματα που προέρχονται από BV2, εξωσώματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κύτταρα BV2 και U87.Η έκφραση του miR-21 έδειξε σημαντική αύξηση στα εξωσώματα από κύτταρα BV2 μολυσμένα με Toxoplasma gondii (στέλεχος RH) (Εικ. 4Β).Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-21 στα κύτταρα BV2 και U87 αυξήθηκαν μετά την πρόσληψη αλλαγμένων εξωσωμάτων (Εικ. 4Β).Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-21 στους εγκεφαλικούς ιστούς ασθενών με όγκο και ποντικών που είχαν μολυνθεί με Toxoplasma gondii (στέλεχος ME49) ήταν υψηλότερα από ό,τι στους μάρτυρες, αντίστοιχα (Εικ. 4C).Αυτά τα αποτελέσματα συσχετίζονται με διαφορές μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των προβλεπόμενων και επιβεβαιωμένων microRNA in vitro και in vivo.
Αλλαγές στην έκφραση του εξωσωματικού miP-21a-5p σε μικρογλοία μολυσμένα με Toxoplasma gondii (RH).(Α) Επιδεικνύει σημαντικές αλλαγές στο siRNA που σχετίζονται με την ανοσία ή την ανάπτυξη όγκου μετά από μόλυνση από T. gondii RH.(Β) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-21 ανιχνεύθηκαν με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο σε εξωσώματα που προέρχονται από BV2, εξωσώματα που έχουν υποστεί αγωγή με BV2 και κύτταρα U87.(Γ) Βρέθηκαν σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-21 στους εγκεφαλικούς ιστούς ασθενών με όγκο (N=3) και ποντικών που είχαν μολυνθεί με Toxoplasma gondii (στέλεχος ME49) (N=3). *Ρ < 0,05 λήφθηκε με τη δοκιμή t Student. *Ρ < 0,05 λήφθηκε με τη δοκιμή t Student. *P < 0,05 было получено со помощью t-критерия Стьюдента. *Ρ < 0,05 λήφθηκε χρησιμοποιώντας το Student's t-test. *P <0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 που λήφθηκε με χρήση του Student's t-test.
Εξωσώματα από κύτταρα BV2 μολυσμένα με RH οδήγησαν στην ανάπτυξη γλοιωμάτων in vivo και in vitro (Εικ. 2, 3).Για να ανιχνεύσουμε σχετικά mRNA, εξετάσαμε τα επίπεδα mRNA των αντικαρκινικών γονιδίων στόχων, του forkhead box O1 (FoxO1), του PTEN και του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 4 (PDCD4) σε κύτταρα U87 μολυσμένα με εξωσώματα που προέρχονται από BV2 ή RH BV2.Η ανάλυση της βιοπληροφορικής έχει δείξει ότι αρκετά γονίδια που σχετίζονται με όγκους, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων FoxO1, PTEN και PDCD4, έχουν θέσεις δέσμευσης miR-2121,22.Τα επίπεδα mRNA των γονιδίων-στόχων κατά του όγκου μειώθηκαν σε εξωσώματα που προέρχονται από BV2 μολυσμένα με RH σε σύγκριση με εξωσώματα που προέρχονται από BV2 (Εικ. 5Α).Το FoxO1 έδειξε μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης σε εξωσώματα που προέρχονται από BV2 μολυσμένα με RH σε σύγκριση με εξωσώματα που προέρχονται από BV2 (Εικόνα 5Β).Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, θα μπορούσαμε να επιβεβαιώσουμε ότι τα εξωσώματα που προέρχονται από το μολυσμένο με RH BV2 ρυθμίζουν προς τα κάτω τα αντιογκογόνα γονίδια, διατηρώντας το ρόλο τους στην ανάπτυξη του όγκου.
Τα μολυσμένα με τοξόπλασμα RH προερχόμενα από το BV2 εξωσώματα επάγουν την καταστολή των αντικαρκινικών γονιδίων σε κύτταρα γλοιώματος U87 από μολυσμένα με τοξόπλασμα RH εξωσώματα που προέρχονται από BV2.(Α) PCR πραγματικού χρόνου της έκφρασης FoxO1, PTEN και PDCD4 σε εξωσώματα που προέρχονται από T. gondii RH-μολυσμένο BV2 σε σύγκριση με εξωσώματα PBS.Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε mRNA β-ακτίνης.(Β) Η έκφραση FoxO1 προσδιορίστηκε με στύπωμα Western και τα δεδομένα πυκνομετρίας αξιολογήθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageJ. *Ρ < 0,05 λήφθηκε με τη δοκιμή t Student. *Ρ < 0,05 λήφθηκε με τη δοκιμή t Student. *P < 0,05 было получено со помощью t-критерия Стьюдента. *Ρ < 0,05 λήφθηκε χρησιμοποιώντας το Student's t-test. *P <0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 που λήφθηκε με χρήση του Student's t-test.
Για να κατανοηθεί η επίδραση του miP-21 στα εξωσώματα στη ρύθμιση γονιδίου που σχετίζεται με τον όγκο, τα κύτταρα U87 επιμολύνθηκαν με έναν αναστολέα του miP-21 χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 και τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση.Τα επίπεδα έκφρασης FoxO1 και p27 σε κύτταρα διαμολυνθέντα με αναστολείς miR-21 συγκρίθηκαν με κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με εξωσώματα που προέρχονται από BV2 χρησιμοποιώντας qRT-PCR (Εικ. 6Α, Β).Η επιμόλυνση του αναστολέα miR-21 σε κύτταρα U87 μείωσε σημαντικά την έκφραση FoxO1 και p27 (Εικόνα 6).
Το μολυσμένο με RH εξωσωματικό miP-21 που προέρχεται από BV2 άλλαξε την έκφραση FoxO1/p27 σε κύτταρα γλοιώματος U87.Τα κύτταρα U87 επιμολύνθηκαν με αναστολέα miP-21 χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 και τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση.Τα επίπεδα έκφρασης FoxO1 και p27 σε κύτταρα διαμολυνθέντα με αναστολείς miR-21 συγκρίθηκαν με επίπεδα σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με εξωσώματα που προέρχονται από BV2 χρησιμοποιώντας qRT-PCR (Α, Β).
Για να ξεφύγει από την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή, το παράσιτο Toxoplasma μεταμορφώνεται σε κύστη ιστού.Παρασιτούν διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, της καρδιάς και των σκελετικών μυών, καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής του ξενιστή και ρυθμίζουν την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή.Επιπλέον, μπορούν να ρυθμίσουν τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση των κυττάρων-ξενιστών, προάγοντας τον πολλαπλασιασμό τους14,24.Το Toxoplasma gondii μολύνει κυρίως τα δενδριτικά κύτταρα του ξενιστή, τα ουδετερόφιλα και τη γραμμή μονοκυττάρων/μακροφάγων, συμπεριλαμβανομένων των μικρογλοίων του εγκεφάλου.Το Toxoplasma gondii επάγει τη διαφοροποίηση των μακροφάγων του φαινοτύπου Μ2, επηρεάζει την επούλωση του τραύματος μετά από μόλυνση από παθογόνο και σχετίζεται επίσης με υπεραγγείωση και κοκκιωματώδη ίνωση.Αυτή η συμπεριφορική παθογένεση της λοίμωξης από τοξόπλασμα μπορεί να σχετίζεται με δείκτες που σχετίζονται με την ανάπτυξη όγκου.Το εχθρικό περιβάλλον που ρυθμίζεται από το Toxoplasma μπορεί να μοιάζει με τον αντίστοιχο προκαρκινικό καρκίνο.Επομένως, μπορεί να υποτεθεί ότι η λοίμωξη από τοξόπλασμα θα πρέπει να συμβάλλει στην ανάπτυξη όγκων του εγκεφάλου.Μάλιστα, έχουν αναφερθεί υψηλά ποσοστά μόλυνσης από τοξόπλασμα στον ορό ασθενών με διάφορους όγκους του εγκεφάλου.Επιπλέον, το Toxoplasma gondii μπορεί να είναι ένας άλλος καρκινογόνος παράγοντας και να δρα συνεργικά για να βοηθήσει άλλα μολυσματικά καρκινογόνα να αναπτύξουν όγκους στον εγκέφαλο.Από αυτή την άποψη, αξίζει να σημειωθεί ότι το P. falciparum και ο ιός Epstein-Barr συμβάλλουν συνεργιστικά στον σχηματισμό του λεμφώματος Burkitt.
Ο ρόλος των εξωσωμάτων ως ρυθμιστών στον τομέα της έρευνας για τον καρκίνο έχει διερευνηθεί εκτενώς.Ωστόσο, ο ρόλος των εξωσωμάτων μεταξύ παρασίτων και μολυσμένων ξενιστών παραμένει ελάχιστα κατανοητός.Μέχρι στιγμής, διάφοροι ρυθμιστές, συμπεριλαμβανομένων των εκκρινόμενων πρωτεϊνών, έχουν εξηγήσει τις βιολογικές διεργασίες με τις οποίες τα πρωτόζωα παράσιτα αντιστέκονται στην επίθεση του ξενιστή και διαιωνίζουν τη μόλυνση.Πρόσφατα, υπάρχει μια αυξανόμενη ιδέα ότι τα μικροκυστίδια που σχετίζονται με πρωτόζωα και τα microRNA τους αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα ξενιστές για να δημιουργήσουν ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την επιβίωσή τους.Ως εκ τούτου, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να ανακαλυφθεί η σχέση μεταξύ των αλλοιωμένων εξωσωματικών miRNAs και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του γλοιώματος.Η αλλαγή του μικροRNA (γονίδια συστάδας miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 και miR-17-92) συνδέεται με τον προαγωγέα STAT3 σε ανθρώπινα μακροφάγα μολυσμένα από τοξόπλασμα, ρυθμίζεται και επάγει αντι -απόπτωση ως απόκριση σε λοίμωξη από Toxoplasma gondii 29 .Η μόλυνση από τοξόπλασμα αυξάνει την έκφραση των miR-17-5p και miR-106b-5p, τα οποία σχετίζονται με αρκετές υπερπολλαπλασιαστικές ασθένειες 30 .Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα miRNAs του ξενιστή που ρυθμίζονται από μόλυνση από τοξόπλασμα είναι σημαντικά μόρια για την επιβίωση και την παθογένεση των παρασίτων στη βιολογική συμπεριφορά του ξενιστή.
Τα τροποποιημένα miRNAs μπορούν να επηρεάσουν διάφορους τύπους συμπεριφοράς κατά την έναρξη και την εξέλιξη των κακοήθων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των γλοιωμάτων: αυτάρκεια σημάτων ανάπτυξης, αναισθησία σε σήματα αναστολής της ανάπτυξης, διαφυγή απόπτωσης, απεριόριστο δυναμικό αναπαραγωγής, αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση και φλεγμονή.Στο γλοίωμα, τα τροποποιημένα miRNAs έχουν εντοπιστεί σε αρκετές μελέτες προφίλ έκφρασης.
Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαιώσαμε υψηλά επίπεδα έκφρασης miRNA-21 σε κύτταρα ξενιστές μολυσμένα με τοξόπλασμα.Το miR-21 έχει αναγνωριστεί ως ένα από τα πιο συχνά υπερεκφραζόμενα microRNA σε συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των γλοιωμάτων, 33 και η έκφρασή του συσχετίζεται με τον βαθμό του γλοιώματος.Τα συσσωρευμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι το miR-21 είναι ένα νέο ογκογονίδιο που δρα ως αντι-αποπτωτικός παράγοντας στην ανάπτυξη του γλοιώματος και υπερεκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους ιστούς και στο πλάσμα των κακοηθειών του ανθρώπινου εγκεφάλου.Είναι ενδιαφέρον ότι η αδρανοποίηση του miR-21 σε κύτταρα και ιστούς γλοιώματος πυροδοτεί την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού λόγω της απόπτωσης που εξαρτάται από την κασπάση.Η βιοπληροφορική ανάλυση των προβλεπόμενων στόχων του miR-21 αποκάλυψε πολλαπλά ογκοκατασταλτικά γονίδια που σχετίζονται με μονοπάτια απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένου του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 4 (PDCD4), της τροπομυοσίνης (TPM1), του PTEN και του κιβωτίου περόνης O1 (FoxO1), με τη θέση δέσμευσης miR-2121..22.38.
Το FoxO1, ως ένας από τους μεταγραφικούς παράγοντες (FoxO), εμπλέκεται στην ανάπτυξη διαφόρων τύπων ανθρώπινου καρκίνου και μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση ογκοκατασταλτικών γονιδίων όπως τα p21, p27, Bim και FasL40.Το FoxO1 μπορεί να δεσμεύσει και να ενεργοποιήσει αναστολείς του κυτταρικού κύκλου όπως το p27 για να καταστείλει την κυτταρική ανάπτυξη.Επιπλέον, το FoxO1 είναι ένας βασικός τελεστής της σηματοδότησης PI3K/Akt και ρυθμίζει πολλές βιολογικές διεργασίες όπως η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και η κυτταρική διαφοροποίηση μέσω της ενεργοποίησης της μεταγραφής του p2742.
Συμπερασματικά, πιστεύουμε ότι το εξωσωματικό miR-21 που προέρχεται από μολυσμένα με τοξόπλασμα μικρογλοία μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο ως ρυθμιστής ανάπτυξης των κυττάρων γλοιώματος (Εικ. 7).Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να βρεθεί μια άμεση σχέση μεταξύ του εξωσωματικού miR-21, της αλλοιωμένης λοίμωξης από τοξόπλασμα και της ανάπτυξης γλοιώματος.Αυτά τα αποτελέσματα αναμένεται να αποτελέσουν ένα σημείο εκκίνησης για τη μελέτη της σχέσης μεταξύ της λοίμωξης από τοξόπλασμα και της επίπτωσης του γλοιώματος.
Σε αυτή τη μελέτη προτείνεται ένα σχηματικό διάγραμμα του μηχανισμού καρκινογένεσης του γλοιώματος (εγκεφάλου).Ο συγγραφέας σχεδιάζει στο PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης ζώων, ήταν σύμφωνα με τις Πρότυπες Δεοντολογικές Κατευθυντήριες Γραμμές για τη Φροντίδα Ζώων και την Επιτροπή Χρηστών του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ και εγκρίθηκαν από το Συμβούλιο Αναθεώρησης Ιδρυμάτων της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ (Αριθμός IRB SNU- 150715).-2).Όλες οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του ARRIVE.
Η μικρογλοία ποντικού BV2 και τα κύτταρα ανθρώπινου γλοιώματος U87 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) και Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), αντίστοιχα, με το καθένα να περιέχει 10% βόειο ορό εμβρύου, 4 mM γλουταμίνη, 0,2 mM πενικιλλίνη και 0,05 mM στρεπτομυκίνη.Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα με 5% CO2 στους 37°C.Μια άλλη κυτταρική σειρά γλοιώματος, U118, χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση με κύτταρα U87.
Για να απομονωθούν εξωσώματα από στελέχη RH και ME49 μολυσμένα με T. gondii, συλλέχθηκαν ταχυζωίτες T. gondii (στέλεχος RH) από την κοιλιακή κοιλότητα ποντικών BALB/c ηλικίας 6 εβδομάδων που είχαν λάβει ένεση 3-4 ημέρες πριν.Οι ταχυζωίτες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και καθαρίστηκαν με φυγοκέντρηση σε 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ)43.Για να ληφθούν ταχυζωίτες του στελέχους ME49, ποντίκια BALB/c ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 20 ιστικές κύστεις και ο μετασχηματισμός ταχυζωίτη σε κύστεις συλλέχθηκε με πλύσιμο της κοιλιακής κοιλότητας την 6-8η ημέρα μετά τη μόλυνση (ΡΙ).Ποντίκια μολυσμένα με PBS.Ταχυζωίτες ME49 αναπτύχθηκαν σε κύτταρα συμπληρωμένα με 100 μg/ml πενικιλίνη (Gibco/BRL, Grand Island, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ), 100 μg/ml στρεπτομυκίνη (Gibco/BRL) και 5% εμβρυϊκό βόειο ορό (Lonza, Walkersville, MD ) .., ΗΠΑ) στους 37 °C και 5% διοξείδιο του άνθρακα.Μετά την καλλιέργεια σε κύτταρα Vero, οι ταχυζωίτες ΜΕ49 πέρασαν δύο φορές μέσω μιας βελόνας 25 gauge και στη συνέχεια μέσω ενός φίλτρου 5 μm για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων και των κυττάρων.Μετά το πλύσιμο, οι ταχυζωίτες επαναιωρήθηκαν σε PBS44.Οι ιστικές κύστεις του στελέχους ΜΕ49 Toxoplasma gondii διατηρήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κύστεων που απομονώθηκαν από τον εγκέφαλο μολυσμένων ποντικών C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Κορέα).Οι εγκέφαλοι ποντικών μολυσμένων με ME49 συλλέχθηκαν μετά από 3 μήνες PI και κομματιάστηκαν σε μικροσκόπιο για να απομονωθούν οι κύστεις.Τα μολυσμένα ποντίκια κρατήθηκαν υπό ειδικές συνθήκες χωρίς παθογόνους παράγοντες (SPF) στην Ιατρική Σχολή του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ.
Το ολικό RNA εξήχθη από εξωσώματα που προέρχονται από BV2, κύτταρα και ιστούς BV2 χρησιμοποιώντας το κιτ miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου επώασης για το βήμα έκλουσης.Η συγκέντρωση RNA προσδιορίστηκε σε φασματοφωτόμετρο NanoDrop 2000.Η ποιότητα των μικροσυστοιχιών RNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας έναν βιοαναλυτή Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Ολλανδία).
DMEM με 10% φτωχό σε εξώσωμα FBS παρασκευάστηκε με υπερφυγοκέντρηση στα 100.000 g για 16 ώρες στους 4°C και διηθήθηκε μέσω φίλτρου 0,22 μm (Nalgene, Rochester, ΝΥ, ΗΠΑ).Κύτταρα BV2, 5 χ 105, καλλιεργήθηκαν σε DMEM που περιείχε 10% FBS χωρίς εξώσωμα και 1% αντιβιοτικά στους 37°C και 5% CO2.Μετά από 24 ώρες επώασης, ταχυζωίτες του στελέχους RH ή ΜΕ49 (ΜΟΙ = 10) προστέθηκαν στα κύτταρα και τα μη εισβάλλοντα παράσιτα απομακρύνθηκαν μέσα σε μία ώρα και ξαναγεμίστηκαν με DMEM.Τα εξωσώματα από τα κύτταρα BV2 απομονώθηκαν με τροποποιημένη διαφορική φυγοκέντρηση, την πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο.Εναιωρήστε ξανά το ίζημα εξωσώματος σε 300 μl PBS για ανάλυση RNA ή πρωτεΐνης.Η συγκέντρωση των απομονωθέντων εξωσωμάτων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) και φασματοφωτόμετρο NanoDrop 2000.
Τα ιζήματα από κύτταρα BV2 ή εξωσώματα που προέρχονται από BV2 λύθηκαν σε διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Κορέα) και οι πρωτεΐνες φορτώθηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 10% SDS με χρώση Coomassie brilliant blue.Επιπλέον, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF για 2 ώρες.Οι κηλίδες Western επικυρώθηκαν χρησιμοποιώντας το αντίσωμα Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, ΗΠΑ) ως εξωσωματικό δείκτη.Ως δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν συζευγμένα με HRP κατσίκα αντι-ποντικού IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) και ένας αναλυτής εικόνας φωταύγειας LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Τόκιο, Ιαπωνία)..Πραγματοποιήθηκε ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης για τη μελέτη του μεγέθους και της μορφολογίας των εξωσωμάτων.Εξωσώματα που απομονώθηκαν από κύτταρα BV2 (6,40 μg/μl) παρασκευάστηκαν σε πλέγματα επικαλυμμένα με άνθρακα και βάφτηκαν αρνητικά με 2% οξικό ουρανύλιο για 1 λεπτό.Τα παρασκευασμένα δείγματα παρατηρήθηκαν σε τάση επιτάχυνσης 80 kV χρησιμοποιώντας JEOL 1200-EX II (Τόκιο, Ιαπωνία) εξοπλισμένο με κάμερα ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Τα προερχόμενα από BV2 εξωσώματα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ συνδετήρων ερυθρού φθορισμού PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Κύτταρα U87, 2×105, με σημασμένα με ΡΚΗ26 εξωσώματα (κόκκινο) ή χωρίς εξωσώματα ως αρνητικό μάρτυρα, επωάστηκαν στους 37°C για 24 ώρες σε επωαστήρα 5% CO2.Οι πυρήνες κυττάρων U87 χρωματίστηκαν με DAPI (μπλε), τα κύτταρα U87 σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά στους 4°C και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε σύστημα συνεστιακού μικροσκοπίου Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Γερμανία).αισθητός.
Το cDNA συντέθηκε από siRNA χρησιμοποιώντας σύνθεση πρώτου κλώνου siRNA Mir-X και κιτ SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης PCR σε πραγματικό χρόνο iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιώντας εκκινητές και πρότυπα αναμεμειγμένα με SYBR Premix.Το DNA ενισχύθηκε για 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95°C για 15 δευτερόλεπτα και ανόπτηση στους 60°C για 60 δευτερόλεπτα.Τα δεδομένα από κάθε αντίδραση PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μονάδα ανάλυσης δεδομένων του λογισμικού οπτικού συστήματος iQ™5 (Bio-Rad).Οι σχετικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ επιλεγμένων γονιδίων-στόχων και β-ακτίνης/siRNA (και U6) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο τυπικής καμπύλης.Οι ακολουθίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα 1.
3 x 104 κύτταρα γλοιώματος U87 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και αναμίχθηκαν με μολυσμένα με τοξόπλασμα εξωσώματα που προέρχονται από BV2 (50 μg/mL) ή μη παλμικά εξωσώματα που προέρχονται από BV2 (50 μg/mL) ως μάρτυρες στις 12, 18 και 36 ώρες .Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (Συμπληρωματικά Σχήματα S1-S3) 46.
Θηλυκά γυμνά ποντίκια BALB/c ηλικίας 5 εβδομάδων αγοράστηκαν από την Orient Bio (Seongnam-si, Νότια Κορέα) και διατηρήθηκαν μεμονωμένα σε αποστειρωμένα κλουβιά σε θερμοκρασία δωματίου (22±2°C) και υγρασία (45±15°C).%) σε θερμοκρασία δωματίου (22±2°C) και υγρασία (45±15%).Ένας κύκλος φωτός 12 ωρών και ένας κύκλος σκότους 12 ωρών διεξήχθησαν με SPF (Σεούλ National University School of Medicine Animal Center).Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες των 5 ποντικών η καθεμία και σε όλες τις ομάδες ενέθηκαν υποδόρια 400 ml PBS που περιείχε 1 x 107 κύτταρα γλοιώματος U87 και μειωμένο αυξητικό παράγοντα BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Έξι ημέρες μετά την ένεση του όγκου, 200 mg εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα BV2 (με/χωρίς μόλυνση από τοξόπλασμα) εγχύθηκαν στην περιοχή του όγκου.Είκοσι δύο ημέρες μετά τη μόλυνση του όγκου, το μέγεθος του όγκου των ποντικών σε κάθε ομάδα μετρήθηκε με παχύμετρο τρεις φορές την εβδομάδα και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον τύπο: 0,5×(πλάτος)×2×μήκος.
Ανάλυση έκφρασης MicroRNA με χρήση miRCURYTM LNA miRNA miRNA, 7ης γενιάς έχει συστοιχίες mmu και rno (EXIQON, Vedbaek, Δανία) που καλύπτουν 1119 καλά χαρακτηρισμένα ποντίκια μεταξύ 3100 ανιχνευτών σύλληψης miRNA ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου.Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, 250 έως 1000 ng ολικού RNA αφαιρέθηκαν από το 5'-φωσφορικό με επεξεργασία με αλκαλική φωσφατάση εντέρου μόσχου που ακολουθείται από επισήμανση με πράσινη φθορίζουσα χρωστική Hy3.Τα επισημασμένα δείγματα στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν με φόρτωση πλακών μικροσυστοιχίας χρησιμοποιώντας κιτ θαλάμου υβριδισμού (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) και κιτ αντικειμενοφόρου υβριδισμού (Agilent Technologies).Ο υβριδισμός πραγματοποιήθηκε για 16 ώρες στους 56°C και στη συνέχεια οι μικροσυστοιχίες πλύθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.Οι επεξεργασμένες διαφάνειες μικροσυστοιχίας στη συνέχεια σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα σάρωσης μικροσυστοιχιών Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Οι σαρωμένες εικόνες εισήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Agilent Feature Extraction έκδοση 10.7.3.1 (Agilent Technologies) και η ένταση φθορισμού κάθε εικόνας ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντίστοιχο αρχείο GAL του τροποποιημένου πρωτοκόλλου Exiqon.Τα δεδομένα μικροσυστοιχίας για την τρέχουσα μελέτη κατατίθενται στη βάση δεδομένων GEO με αριθμό πρόσβασης GPL32397.
Τα προφίλ έκφρασης ώριμων εξωσωματικών miRNAs σε μικρογλοία στελεχών RH ή ME49 που έχουν μολυνθεί με τοξόπλασμα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας διάφορα εργαλεία δικτύου.Τα miRNA που σχετίζονται με την ανάπτυξη όγκου ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) και φιλτραρίστηκαν με κανονικοποιημένη ένταση σήματος (log2) μεγαλύτερη από 8,0.Μεταξύ των miRNAs, τα διαφορικά εκφραζόμενα miRNA βρέθηκαν να έχουν αλλοιωθεί περισσότερο από 1,5 φορές με ανάλυση φίλτρου των miRNAs που έχουν τροποποιηθεί από στελέχη RH ή ME49 που έχουν μολυνθεί με T. gondii.
Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων (3 χ 105 κύτταρα/φρεάτιο) σε opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Τα επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 6 ώρες και στη συνέχεια το μέσο άλλαξε σε φρέσκο ​​πλήρες μέσο.Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση.
Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε κυρίως με τη χρήση του Student's t-test με λογισμικό Excel (Microsoft, Washington, DC, ΗΠΑ).Για ανάλυση σε πειραματόζωα, πραγματοποιήθηκε μια αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Οι τιμές P < 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι τιμές P < 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Οι τιμές P <0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P<0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Οι τιμές P <0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.
Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκαν από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ (αριθμός IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Εκτιμώμενη παγκόσμια επίπτωση και θνησιμότητα από καρκίνο το 2018: Πηγές και μέθοδοι GLOBOCAN.Ερμηνεία.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Μια εικόνα για τους παράγοντες κινδύνου των όγκων του εγκεφάλου και τις θεραπευτικές παρεμβάσεις τους. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Μια εικόνα για τους παράγοντες κινδύνου των όγκων του εγκεφάλου και τις θεραπευτικές παρεμβάσεις τους.Rashid, S., Rehman, K. and Akash, MS Μια ανασκόπηση των παραγόντων κινδύνου για όγκους εγκεφάλου και μείζονες θεραπευτικές παρεμβάσεις. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Βαθιά κατανόηση των παραγόντων κινδύνου όγκου εγκεφάλου και των θεραπευτικών παρεμβάσεων.Rashid, S., Rehman, K. and Akash, MS Μια ανασκόπηση των παραγόντων κινδύνου για όγκους εγκεφάλου και μείζονες θεραπευτικές παρεμβάσεις.Βιοιατρική επιστήμη.Φαρμακοποιός.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Βακτηριακές-ιικές αλληλεπιδράσεις σε καρκίνους ανθρώπινου στοματοπεπτικού και γυναικείου γεννητικού συστήματος: Σύνοψη επιδημιολογικών και εργαστηριακών στοιχείων. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Βακτηριακές-ιικές αλληλεπιδράσεις σε καρκίνους ανθρώπινου στοματοπεπτικού και γυναικείου γεννητικού συστήματος: Σύνοψη επιδημιολογικών και εργαστηριακών στοιχείων.Kato I., Zhang J. και Sun J. Αλληλεπιδράσεις βακτηρίων-ιών στον καρκίνο του ανθρώπινου γαστρεντερικού σωλήνα και της γυναικείας γεννητικής οδού: μια περίληψη επιδημιολογικών και εργαστηριακών δεδομένων. Κάτο, Ι., Ζανγκ, Τζ. & Σουν, Τζ. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Βακτηριοϊική αλληλεπίδραση στην πέψη της ανθρώπινης στοματικής κοιλότητας και στη γυναικεία αναπαραγωγική οδό: περίληψη της επιστήμης της δημοφιλούς ασθένειας και εργαστηριακών στοιχείων.Kato I., Zhang J. και Sun J. Αλληλεπιδράσεις βακτηρίων-ιών στον ανθρώπινο καρκίνο του γαστρεντερικού και στον καρκίνο των γυναικείων γεννητικών οργάνων: μια σύνοψη επιδημιολογικών και εργαστηριακών δεδομένων.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Από τη μόλυνση στον καρκίνο: Πώς οι ιοί όγκου DNA αλλάζουν τον κεντρικό μεταβολισμό του άνθρακα και των λιπιδίων του κυττάρου ξενιστή. Magon, KL & Parish, JL Από τη μόλυνση στον καρκίνο: Πώς οι ιοί όγκου DNA αλλάζουν τον κεντρικό μεταβολισμό του άνθρακα και των λιπιδίων του κυττάρου ξενιστή.Mahon, KL and Parish, JL Μόλυνση από φωτιά στον καρκίνο: πώς οι ιοί όγκου που βασίζονται στο DNA αλλάζουν τον κεντρικό άνθρακα και τον μεταβολισμό των λιπιδίων του κυττάρου ξενιστή. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Από τη μόλυνση στον καρκίνο: πώς οι ιοί όγκου DNA μεταβάλλουν τον κεντρικό μεταβολισμό του άνθρακα και των λιπιδίων του κυττάρου ξενιστή.Mahon, KL και Parish, JL Φωτιά μόλυνση στον καρκίνο: πώς οι ιοί όγκου DNA μεταβάλλουν τον κεντρικό μεταβολισμό του άνθρακα και των λιπιδίων στα κύτταρα ξενιστές.Ανοιχτή Βιολογία.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Κατεχολικά οιστρογόνα σχιστοσωμάτων και ηπατικών φλοκών και καρκίνος που σχετίζεται με έλμινθους.εμπρός.ζεστό μέσα.5, 444 (2014).