Το Giardia duodenum είναι ένας παρασιτικός οργανισμός που προκαλεί γιαρδιάση, μια εντερική λοίμωξη ιδιαίτερα συχνή σε μικρά παιδιά με κλινικά σημεία διάρροιας.Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι το εξωκυτταρικό G. duodenalis πυροδοτεί την ενεργοποίηση νουκλεοτιδίων που δεσμεύουν τον υποδοχέα 3 (NLRP3) που μοιάζει με ενδοκυτταρικό ολιγομερισμό και ρυθμίζει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις του ξενιστή μέσω της έκκρισης εξωκυτταρικών κυστιδίων (EV).Ωστόσο, τα ακριβή μοριακά μοτίβα του σχετιζόμενου με το παθογόνο δωδεκαδακτυλικό EV (GEV) που εμπλέκεται σε αυτή τη διαδικασία και ο ρόλος του φλεγμονώδους NLRP3 στη γιαρδίαση μένει να διευκρινιστεί.
Κατασκευάστηκαν ανασυνδυασμένα ευκαρυωτικά πλασμίδια έκφρασης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνες σε GEV, επιμολύνθηκαν σε πρωτογενή περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού και ανιχνεύθηκαν με μέτρηση του μορίου στόχου της φλεγμονής κασπάση-1.Το επίπεδο έκφρασης ρ20 εξετάστηκε..Οι άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνες G. duodenalis αναγνωρίστηκαν αρχικά με μέτρηση φλεγμονώδους NLRP3 (NLRP3, προ-ιντερλευκίνη-1 βήτα [IL-1β], προ-κασπάση-1 και κασπάση-1 ρ20), έκκριση IL.Επίπεδα 1β, επίπεδα ολιγομερισμού αποπτωτικής κηλίδας πρωτεΐνης (ASC) και εντοπισμός ανοσοφθορισμού NLRP3 και ASC.Ο ρόλος του φλεγμονώδους NLRP3 στην παθογένεια του G. duodenalis στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ποντίκια στα οποία αποκλείστηκε η ενεργοποίηση του NLRP3 (μπλοκαρισμένα ποντίκια NLRP3) και παρακολουθήθηκαν παθολογικές αλλαγές στο σωματικό βάρος, το παρασιτικό φορτίο του δωδεκαδακτύλου και τον δωδεκαδακτυλικό ιστό.Επιπλέον, διερευνήσαμε εάν οι ιαρδίνες άλφα-2 και άλφα-7.3 επάγουν έκκριση IL-1β in vivo μέσω του φλεγμονώδους NLRP3 και προσδιορίσαμε τον ρόλο αυτών των μορίων στην παθογένεια του G. duodenalis σε ποντικούς.
Οι άλφα-2 και άλφα-7,3 γιαρδίνες επάγουν την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους σώματος NLRP3 in vitro.Αυτό οδήγησε στην ενεργοποίηση της ρ20 κασπάσης-1, αύξηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών NLRP3, pro-IL-1β και προ-κασπάσης-1, σημαντική αύξηση στην έκκριση IL-1β, σχηματισμό κηλίδων ASA στην κυτταρόπλασμα, και την επαγωγή ολιγομερισμού ΑΣΟ.Φλεγμονή NLRP3 Η απώλεια του πέους επιδεινώνει την παθογένεια του G. duodenalis σε ποντίκια.Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κύστεις με καθετήρα από ποντίκια αποκλεισμένα με NLRP3 εμφάνισαν αυξημένο αριθμό τροφοζωιτών και σοβαρή βλάβη στις δωδεκαδακτυλικές λάχνες, που χαρακτηρίζονται από νεκρωτικές κρύπτες με συρρίκνωση και διακλάδωση.Πειράματα in vivo έδειξαν ότι οι γιαρδίνες άλφα-2 και άλφα-7.3 μπορούν να προκαλέσουν έκκριση IL-1β μέσω του φλεγμονώδους NLRP3 και η ανοσοποίηση με γιαρδίνες άλφα-2 και άλφα-7.3 μείωσε την παθογένεια του G. duodenalis σε ποντικούς.
Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υποδεικνύουν ότι το giardia alpha-2 και το alpha-7.3 προκαλούν προς τα πάνω ρύθμιση της φλεγμονής του NLRP3 του ξενιστή και μειώνουν τη μολυσματικότητα του G. duodenalis σε ποντίκια, τα οποία είναι πολλά υποσχόμενοι στόχοι για την πρόληψη της γιαρδιάσης.
Το Giardia duodenum είναι ένα εξωκυτταρικό πρωτόζωο παράσιτο που ζει στο λεπτό έντερο και προκαλεί 280 εκατομμύρια περιπτώσεις γιαρδιάσης με διάρροια ετησίως, ειδικά σε μικρά παιδιά στις αναπτυσσόμενες χώρες [1].Οι άνθρωποι μολύνονται από το πόσιμο νερό ή τρόφιμα μολυσμένα με κύστεις M. duodenum, οι οποίες στη συνέχεια εισέρχονται στο στομάχι και απεκκρίνονται στα γαστρικά υγρά.Τα τροφοζωίδια του δωδεκαδακτύλου Giardia προσκολλώνται στο επιθήλιο του δωδεκαδακτύλου, προκαλώντας ναυτία, έμετο, διάρροια, κοιλιακό άλγος και απώλεια βάρους.Τα άτομα με ανοσοανεπάρκεια και κυστική ίνωση είναι επιρρεπή στη μόλυνση.Η μόλυνση μπορεί επίσης να συμβεί μέσω του στοματικού και πρωκτικού σεξ [2].Φάρμακα όπως η μετρονιδαζόλη, η τινιδαζόλη και η νιταζοξανίδη είναι οι προτιμώμενες θεραπευτικές επιλογές για τις λοιμώξεις του δωδεκαδακτύλου [3].Ωστόσο, αυτά τα φάρμακα χημειοθεραπείας προκαλούν ανεπιθύμητες παρενέργειες όπως ναυτία, καρκινογένεση και γονοτοξικότητα [4].Επομένως, πρέπει να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματικές στρατηγικές για την πρόληψη της μόλυνσης από G. duodenalis.
Τα φλεγμονοσώματα είναι μια κατηγορία συμπλεγμάτων κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών που αποτελούν μέρος της έμφυτης ανοσοαπόκρισης, βοηθώντας στην άμυνα έναντι της εισβολής παθογόνων και μεσολαβούν στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις [5].Μεταξύ αυτών των φλεγμονών, έχει μελετηθεί εκτενώς ο υποδοχέας ολιγομερισμού δέσμευσης νουκλεοτιδίων (NOD) 3 (NLRP3) ολιγομερισμός νουκλεοτιδίου (NLRP3) που μοιάζει με νουκλεοτιδική δέσμευση, επειδή μπορεί να ανιχνευθεί από διάφορα παθογόνα/μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με βλάβες DAMP), αναγνωρίζει, ενεργοποιεί το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα.και ρυθμίζει την εντερική ομοιόσταση σε πολλές φλεγμονώδεις ασθένειες [6,7,8].Αποτελείται από τον υποδοχέα αναγνώρισης προτύπων (PRR) NLRP3, μια αποπτωτική κηλιδωτή πρωτεΐνη προσαρμογής (ASC) και έναν τελεστή προκασπάση-1 ή προκασπάση-11.Το φλεγμονώδες NLRP3 δρα ως ξενιστής κατά της εισβολής παθογόνου, όπως παρατηρήθηκε στις μελέτες Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] και Leishmania.[11], αλλά έχει επίσης αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 περιορίζει τις προστατευτικές ανοσολογικές αποκρίσεις και επιδεινώνει την εξέλιξη της νόσου, για παράδειγμα, στα σκουλήκια [12].Με βάση τα προηγούμενα ευρήματά μας, αναφέραμε ότι το εξωκυτταρικό G. duodenalis πυροδοτεί την ενδοκυτταρική ενεργοποίηση της φλεγμονής του NLRP3 και ρυθμίζει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις του ξενιστή εκκρίνοντας εξωκυτταρικά κυστίδια (EVs) [13].Ωστόσο, ο ρόλος του φλεγμονώδους NLRP3 στη μόλυνση με G. duodenalis in vivo παραμένει να προσδιοριστεί.
Οι γιαρδίνες περιγράφηκαν αρχικά ως δομικά συστατικά του κυτταροσκελετού του G. duodenalis και παίζουν σημαντικό ρόλο στην κινητικότητα των τροφοζωιτών και στην προσκόλληση των επιθηλιακών κυττάρων στο λεπτό έντερο.Για να προσαρμοστούν καλύτερα στο περιβάλλον και να αυξήσουν την παθογένειά τους, οι τροφοζωίτες G. duodenalis ανέπτυξαν μια μοναδική κυτταροσκελετική δομή που αποτελείται από 8 μαστίγια, 1 μεσαίο σώμα και 1 κοιλιακό δίσκο [14].Οι τροφοζωίτες του Giardia duodenum χρησιμοποιούν τον κυτταροσκελετό τους για να διεισδύσουν στο άνω λεπτό έντερο, ιδιαίτερα στο δωδεκαδάκτυλο, και να προσκολληθούν στα εντεροκύτταρα.Μεταναστεύουν συνεχώς και προσκολλώνται στα επιθηλιακά κύτταρα χρησιμοποιώντας τον κυτταρικό μεταβολισμό.Επομένως, υπάρχει στενή σχέση μεταξύ του κυτταροσκελετού και της λοιμογόνου δράσης τους.Οι γιαρδίνες που είναι ειδικές για το Giardia duodenum είναι συστατικά της δομής του κυτταροσκελετού [15] και χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες: α-, β-, γ- και δ-γιαρδίνες.Υπάρχουν 21 μέλη της οικογένειας της α-γιαρδίνης, όλα από τα οποία έχουν μια εξαρτώμενη από το ασβέστιο ικανότητα να δεσμεύουν φωσφολιπίδια [16].Συνδέουν επίσης τον κυτταροσκελετό με την κυτταρική μεμβράνη.Σε άτομα με διάρροια που προκαλείται από G. duodenalis, οι α-γιαρδίνες εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό και ανοσοαντιδρούν κατά τη διάρκεια της μόλυνσης [17].Τα ετερόλογα εμβόλια που βασίζονται στο Giardia alfa-1 προστατεύουν από τη γιαρδιάση σε ποντίκια και είναι πιθανά υποψήφια αντιγόνα για την ανάπτυξη εμβολίου [18].Η άλφα-8 γιαρδίνη, εντοπισμένη στη πλασματική μεμβράνη και στα μαστίγια, αλλά όχι στον κοιλιακό δίσκο, ενισχύει την κινητικότητα και τον ρυθμό ανάπτυξης των τροφοζωιτών στο G. duodenalis [19].Η άλφα-14 γιαρδίνη προσκολλάται σε δομές μικροσωληνίσκων στα μαστίγια και επηρεάζει τη βιωσιμότητα του G. duodenalis [20].Η άλφα-11 γιαρδίνη υπάρχει σε αφθονία σε όλο τον κύκλο ζωής και η υπερέκφραση της άλφα-11 γιαρδίνης βλάπτει το ίδιο το G. duodenalis [21].Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν η άλφα-2 γιαρδίνη και η άλφα-7,3 γιαρδίνη είναι προστατευτικά έναντι της λοίμωξης από G. duodenalis και των υποκείμενων μηχανισμών τους.
Σε αυτή τη μελέτη, ανασυνδυασμένα ευκαρυωτικά πλασμίδια έκφρασης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 giardine και pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine επιμολύνθηκαν σε πρωτογενή περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού για να ενεργοποιήσουν το NLRP3 του ξενιστή.Στη συνέχεια εξετάστηκαν οι φλεγμονώδεις στόχοι.Αξιολογήσαμε επίσης τον ρόλο του φλεγμονώδους NLRP3 στην παθογένεια του G. duodenalis, διερευνήσαμε εάν οι άλφα-2 και άλφα-7,3 γιαρδίνες επάγουν την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 in vivo και προσδιορίσαμε ότι αυτοί οι δύο ρόλοι των γιαρδινών στην παθογένεια του G. duodenalis.Κοινός μας στόχος ήταν να αναπτύξουμε πολλά υποσχόμενους στόχους για την πρόληψη της λοίμωξης από G. duodenalis.
Άγριου τύπου (WT) C57BL/6 θηλυκά ποντίκια ηλικίας 5-8 εβδομάδων αγοράστηκαν από το Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Κίνα).Τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση στο νερό, έλαβαν αποστειρωμένη τροφή και διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 12/12 ωρών.Πριν από τη μόλυνση, τα ποντίκια έλαβαν αντιβιοτικά κατά βούληση σε πόσιμο νερό συμπληρωμένα με αμπικιλλίνη (1 mg/mL), βανκομυκίνη (1 mg/mL) και νεομυκίνη (1,4 mg/mL) (όλα που αγοράστηκαν από τη Σαγκάη, Κίνα, τεχνητούς οργανισμούς) [22 ].].Τα ποντίκια που έχασαν την ικανότητα να τρώνε και να πίνουν για > 24 ώρες και έχασαν ≥ 20% σωματικό βάρος υπέστησαν ευθανασία με εξάρθρημα του τραχήλου της μήτρας.
Οι τροφοζωίτες WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) συμπληρώθηκαν με 12,5% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS; Every Green, Zhejiang, Κίνα) και 0,1% βόεια χολή (Sigma-Aldrich, St. Missouri, ΗΠΑ ).ΗΠΑ) υπό μικροαερόβιες συνθήκες.Τα συρρέοντα τροφοζωίδια συλλέχθηκαν σε πάγο και διοχετεύθηκαν σε αναλογία 1:4 για περαιτέρω αναπαραγωγή.
Οι κύστεις του δωδεκαδακτύλου Giardia προκλήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], οι τροφοζωίτες συλλέχθηκαν σε λογαριθμική φάση και στη συνέχεια αραιώθηκαν με μέσο επαγωγής ενθυλάκωσης, pH 7,1 (τροποποιημένο TYI-S-33) σε τελική συγκέντρωση 1 × 106 τροφοζωίτες/mL.συγκέντρωση χολής 0,05% μέσο).Οι τροφοζωίτες καλλιεργήθηκαν υπό αναερόβιες συνθήκες στους 37°C μέχρι τη φάση της λογαριθμικής ανάπτυξης.Αλλάξτε το μέσο σε μέσο επαγωγής κύστης (pH 7,8, τροποποιημένο μέσο TYI-S-33 με 1% συγκέντρωση χολής) και καλλιεργήστε το G. duodenalis στους 37°C για 48–96 ώρες, κατά τις οποίες παρατηρήθηκαν οι κύστεις σχηματισμού στο μικροσκόπιο.Αφού τα περισσότερα από τα τροφοζωίδια είχαν επαχθεί να σχηματίσουν κύστεις, το μίγμα της καλλιέργειας συλλέχθηκε και επαναιωρήθηκε σε στείρο απιονισμένο νερό για λύση των υπόλοιπων τροφοζωιτών.Οι κύστεις μετρήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 4°C για επακόλουθες αναλύσεις μέσω γαστρικού σωλήνα σε ποντίκια.
Τα εξωκυτταρικά κυστίδια Giardia (GEVs) εμπλουτίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].Τροφοζωίτες σε φάση λογαριθμικής ανάπτυξης επαναιωρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο TYI-S-33 που παρασκευάστηκε με FBS χωρίς εξώσωμα (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) σε τελική συγκέντρωση 1 x 106 παράσιτα/mL και επωάστηκαν για 12 ώρες.απομονώθηκαν από το υπερκείμενο της καλλιέργειας με φυγοκέντρηση στα 2000 g για 10 λεπτά, 10.000 g για 45 λεπτά και 100.000 g για 60 λεπτά.Τα ιζήματα διαλύθηκαν σε αλατούχο ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS), ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) και αποθηκεύτηκαν στους -80°C ή χρησιμοποιήθηκαν απευθείας για περαιτέρω αναλύσεις.
Τα πρωτογενή περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].Εν συντομία, ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) ενέθηκαν (ενδοπεριτοναϊκά [ip]) με 2,5 ml υγρού μέσου θειογλυκόλης 2,98% Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) και τράφηκαν 3-4 ουρανίσκους.Ένα εναιώρημα μακροφάγων συλλέχθηκε από την κοιλιακή κοιλότητα ποντικών μετά από ευθανασία και φυγοκεντρήθηκε 3 φορές στα 1000 g για 10 λεπτά.Τα συλλεχθέντα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τον δείκτη CD11b έως ότου η κυτταρική καθαρότητα ήταν >98%, στη συνέχεια προστέθηκαν σε πλάκες κυτταροκαλλιέργειας 6 φρεατίων (4,5 χ 106 κύτταρα/φρεάτιο) και επωάστηκαν με 10% FBS (Bioinustry) στους 37°C.και 5% CO2.
Το RNA εκχυλίστηκε από 1 × 107 τροφοζωίτες σε 1 ml αντιδραστηρίου TRIzol (Vazyme, Nanjing, Κίνα), το γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε από το συνολικό RNA του G. duodenalis χρησιμοποιώντας dsDNase MonScript (Monad, Wuhan, Κίνα) και συντέθηκε συμπληρωματικό DNA (cDNA). χρησιμοποιώντας MonScript RTIIII Super Mix (Monad) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Οι πληροφορίες της ακολουθίας CDS για το γονίδιο στόχο G. duodenalis ελήφθησαν από την NCBI GenBank.Χρησιμοποιήστε το Primer 5.0 για να σχεδιάσετε συγκεκριμένους εκκινητές κλωνοποίησης χωρίς ραφή για κάθε γονίδιο στόχο.Ο μπροστινός εκκινητής (5'-3') αποτελείται από τρία μέρη: μια αλληλοκαλυπτόμενη αλληλουχία με έναν γραμμικό φορέα pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) και τα κωδικόνια έναρξης ATG και GNN (εάν η πρώτη βάση δεν είναι G).Αυτό γίνεται για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της έκφρασης.Επιπλέον, τουλάχιστον 16 bp συνδυασμένες βάσεις (περιεκτικότητα GC 40–60%/Tm περίπου 55 °C).Ο αντίστροφος εκκινητής (5'-3') αποτελείται από δύο μέρη, μια αλληλοκαλυπτόμενη αλληλουχία με έναν γραμμικοποιημένο με EcoRV φορέα pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) και μια συνδυασμένη βάση τουλάχιστον 16 bp.(εξαιρουμένων των δύο τελευταίων στάσεων).βάσεις) ένα κωδικόνιο όπως AA ή GA για να επιτρέψει στα ανασυνδυασμένα πλασμίδια να εκφράσουν τις επισημασμένες πρωτεΐνες τους).Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα 1 και συντέθηκαν από την Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Κίνα).
Οι στόχοι ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας πολυμεράση Pfu DNA (Tiangen, Πεκίνο, Κίνα) ή Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Κίνα) χρησιμοποιώντας παρασκευασμένο cDNA G. duodenalis ως πρότυπο.Το πλασμίδιο pcDNA3.1(+) ευκαρυωτικού φορέα έκφρασης γραμμικοποιήθηκε με ένζυμο περιορισμού EcoRV και αποφωσφορυλιώθηκε χρησιμοποιώντας Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Τα γραμμικά κομμάτια pcDNA3.1(+) και τα ενισχυμένα θραύσματα γονιδίου στόχου καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού γέλης DNA (Tiangen) και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Το θραύσμα pcDNA3.1(+) και κάθε θραύσμα γονιδίου στόχου ανασυνδυάστηκαν χρησιμοποιώντας μίγμα κλωνοποίησης μονής διάταξης MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Κίνα) και επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA χρησιμοποιώντας Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Κίνα)..
Τα πλασμίδια χωρίς ενδοτοξίνες pcDNA3.1(+)-άλφα-2 και pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το SanPrep χωρίς ενδοτοξίνη Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Η συγκέντρωση διατηρήθηκε πάνω από 500 ng/μl για να εξασφαλιστεί ότι το EDTA στο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης δεν παρενέβη στον προσδιορισμό επιμόλυνσης.Πρωτογενή περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων με πλήρες μέσο RPMI 1640 (Biological Industries) για 12 ώρες, στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές σε ζεστό PBS για να απομακρυνθούν η πενικιλλίνη και η στρεπτομυκίνη και στη συνέχεια σε μέσο συμπληρωμένο με πλήρες μέσο.Τα πλασμίδια χωρίς ενδοτοξίνες pcDNA3.1(+)-άλφα-2 και pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 (2,5 μg) αραιώθηκαν σε 125 μl μέσου ορού μειωμένου Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Στη συνέχεια, 5 μΙ αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) αραιώθηκαν σε 125 μl μέσου Opti-MEM με χαμηλό ορό.Παρασκευάστε σύμπλοκα λιποσώματος-DNA αναμειγνύοντας το αραιωμένο πλασμίδιο χωρίς ενδοτοξίνες με Lipofectamine 2000 και αφήνοντας το μείγμα να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά.Μεταφέρετε τα σύμπλοκα χωριστά σε κύτταρα σε κάθε φρεάτιο και ανακατεύετε αργά.Μετά από 4 ώρες, το μέσο κυτταροκαλλιέργειας αντικαταστάθηκε με 2 ml πλήρους μέσου RPMI 1640 και η καλλιέργεια συνεχίστηκε για 24 ώρες.Φρέσκο ​​μέσο κυτταροκαλλιέργειας προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκε για διάφορα χρονικά σημεία ανάλογα με τον σχεδιασμό της δοκιμασίας.
Δείγματα πρωτεΐνης από υπερκείμενα και κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].Οι παράμετροι μεταφοράς μεμβράνης για pro-IL-1β, προ-κασπάση-1, κασπάση-1 ρ20, NLRP3, β-ακτίνη και His-tag ήταν 200 mA/90 λεπτά.Για την ιντερλευκίνη 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, ΗΠΑ), την κασπάση-1 (p20) (Adipogen, Ελβετία) και το NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Ελβετία) και 1:5000 με στόχευση της ετικέτας His ( Amylet Scientific, Wuhan, Κίνα) και β-ακτίνη (Proteintech, Wuhan, Κίνα).
Η διασύνδεση με υποβρικό διηλεκτριμίδιο (DSS) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με ψυχρό PBS και λύθηκαν πλήρως με βελόνα 27 gauge σε 50 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης ASC (ρΗ 8,0) που περιείχε 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES και 125 mM NaHC03.Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στα 5000 g για 3 λεπτά και το ίζημα ράφτηκε με 10 μΐ DSS (25 mM σε DMSO) και 40 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης ASC για 30 λεπτά στους 37°C.Μετά από φυγοκέντρηση στα 5000 g για 10 λεπτά, το ίζημα διαλύθηκε σε ένα διάλυμα 40 μl ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης ASC και 10 μl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης πρωτεΐνης 6x (TransGen, Πεκίνο, Κίνα) και στη συνέχεια το διάλυμα σβήστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 15 ελάχ., Στη συνέχεια βράστε 10 λεπτά.Δείγματα πρωτεΐνης στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα αντι-ASC (Wanleibio, Shenyang, China) σε αναλογία αραίωσης 1:500.
Ακολουθώντας μια διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [13], τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκαν και η έκκριση της προφλεγμονώδους κυτοκίνης IL-1β προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ IL-1 Beta ELISA ποντικού (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Μετατρέψτε τις τιμές OD450nm σε συγκεντρώσεις πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας την πρότυπη καμπύλη IL-1β.
Κύτταρα επικαλυμμένα σε καλυπτρίδες πλύθηκαν απαλά 3 φορές σε ζεστό PBS, στερεώθηκαν σε σταθεροποιητικό κυττάρων ιστού (Biosharp, Beijing, China) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), σε 0,1% Triton X-Permeabilize στους 100°C (αραιωμένο σε PBS, Biosharp ) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αποκλεισμός σε 5% αλβουμίνη ορού βοοειδών (σε PBS) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου.Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C με πρωτογενή αντισώματα έναντι ASC (αραίωση 1:100) ή NLRP3 (αραίωση 1:100), αντίστοιχα, και σημασμένο με Cy3 κατσίκα αντι-κουνελιού IgG(H+L) (1:400· EarthOx , San Francisco, CA, USA) ή συζευγμένο με FITC κατσίκα αντι-ποντικού IgG (1:400; Earthox) όλη τη νύχτα στους 37°C στο σκοτάδι για 1 ώρα.Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με Hoechst 33258 (10 μg/ml, UE, Suzhou, Κίνα) για 5 λεπτά και παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία).
Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (n = 7 σε κάθε ομάδα): (i) Ομάδα αρνητικού ελέγχου που έλαβε αγωγή με PBS (μόνο PBS· καθετήρας 100 μl/PBS ποντικού ακολουθούμενη από ημερήσια ενδοπεριτοναϊκή ένεση 100 μl/PBS ποντικού 3 ώρες αργότερα)., συνεχώς για 7 ημέρες).(ii) ομάδα αρνητικού ελέγχου που υποβλήθηκε σε θεραπεία με αναστολέα MCC950 [27] (100 μl/ποντίκι μέσω καθετήρα PBS, 3 ώρες αργότερα, 10 mg/kg σωματικού βάρους [BW] MCC950 [σε PBS] χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά καθημερινά, διάρκεια 7 ημέρες).(iii) Ομάδα μόλυνσης από κύστη G. duodenalis (1,5 x 106 κύστεις/ποντικό με καθετηριασμό, 3 ώρες αργότερα, 100 μl/ποντικό PBS ενδοπεριτοναϊκά χορηγούμενα καθημερινά για 7 ημέρες).(iv) Ομάδα θεραπείας με αναστολέα MCC950 συνδυασμένης κύστης G. duodenalis (1,5×106 κύστεις/ποντικό μέσω καθετήρα, 10 mg/kg σωματικού βάρους MCC950 ενδοπεριτοναϊκά ημερησίως για 7 ημέρες στις 3 ώρες).Το σωματικό βάρος κάθε ποντικού παρακολουθούνταν καθημερινά και όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία την 7η ημέρα.Το συλλεχθέν δωδεκαδάκτυλο (μήκους 3 cm) κόπηκε σε μικρά κομμάτια σε 1 ml PBS, οι κύστεις καταστράφηκαν όλη τη νύχτα σε PBS στους 4°C και τροφοζωίτες G. duodenalis.Φρέσκο ​​δωδεκαδάκτυλο (μήκους 1 cm) απομονώθηκε για χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η&Ε).
Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: (i) ομάδα ελέγχου MOCK και (ii) ομάδα αναστολέα MCC950.Υπήρχαν πέντε θεραπείες σε κάθε ομάδα (n = 7/ομάδα θεραπείας): (i) ομάδα ελέγχου αρνητικής αγωγής με PBS (μόνο PBS· 100 μl/PBS ποντικού, ενδομυϊκή (ΙΜ) ένεση (κνημιαία πρόσθια) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) πλασμιδική ομάδα αρνητικού ελέγχου (100 μg/DNA ποντικού, μέσω ενδομυϊκής ένεσης) ομάδα ελέγχου λοίμωξης από G. duodenalis (1,5 x 106 κύστεις/ποντικό, μέσω καθετήρα) (iv) α. ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με πλασμίδιο pcDNA3.1(+)-άλφα-2 (100 μg/DΝΑ ποντικού, με ενδομυϊκή ένεση) και (v) ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με πλασμίδιο pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 (100 μg/ποντικό DNA, μετά από 12 ώρες μετάβασης, τα ποντίκια στην ομάδα αναστολέα MCC950 έλαβαν ημερήσια ενδοπεριτοναϊκή ένεση MCC950 (10 mg/kg σωματικού βάρους) για 7 ημέρες, ενώ τα ποντίκια στην ομάδα MOCK έλαβαν ίσο όγκο θεραπείας με PBS. Δείγματα αίματος έλαβαν συλλέχθηκαν από τους βολβούς των ματιών και αφέθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 °C. Απομονώθηκαν δείγματα ορού χρησιμοποιώντας ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) και μετρήσεις των επιπέδων IL-1β.
Τριάντα πέντε ποντίκια χωρίστηκαν σε πέντε ομάδες (η=7/ομάδα).Η ομάδα 1 ήταν μια ομάδα αρνητικού ελέγχου που έλαβε θεραπεία με PBS: τα ποντίκια έλαβαν 100 μl PBS ενδομυϊκά και 3 ημέρες αργότερα με καθετήρα.Η ομάδα 2 είναι μια ομάδα θετικού μάρτυρα μολυσμένη με κύστεις G. duodenalis: σε ποντίκια ενέθηκαν 100 μl PBS και 3 ημέρες αργότερα 1,5 x 106 κύστεις/ποντικό ενέθηκαν ενδογαστρικά.Τρίτη ομάδα – ανοσοποίηση πλασμιδίου με pcDNA3.1(+) σε συνδυασμό με ομάδα ελέγχου για μόλυνση από δωδεκαδακτυλική κύστη: ποντίκια έλαβαν 100 μg πλασμιδικού DNA pcDNA3.1(+)(im) από το στόμα, 1,5×106 κύστεις/ποντίκι 3 για αρκετές ημέρες.Οι ομάδες 4 και 5 ήταν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνης ή πλασμίδιο pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 γιαρδίνης σε συνδυασμό με μόλυνση κύστης G. duodenalis.Πειραματική ομάδα: ποντίκια έλαβαν 100 μg pcDNA3.1(+)-γιαρδίνη πλασμίδιο DNA (im), στη συνέχεια 3 ημέρες αργότερα, 1,5 x 106 κύστεις/ποντικό εγχύθηκαν μέσω καθετήρα.Το σωματικό βάρος κάθε ποντικού παρακολουθήθηκε μετά την εισαγωγή της κύστης G. duodenalis μέσω του σωλήνα.Συλλέχθηκε φρέσκο ​​δωδεκαδάκτυλο για μετρήσεις παρασιτικού φορτίου και ανάλυση χρώσης HE.
Οι ιστοπαθολογικές αλλαγές αναλύθηκαν σύμφωνα με μια προηγουμένως δημοσιευμένη διαδικασία [30].Το φρέσκο ​​δωδεκαδάκτυλο στερεώθηκε με σταθεροποιητικό κυττάρων ιστού, ενσωματώθηκε σε παραφίνη, κόπηκε σε τομές 4 μm, χρωματίστηκε με H&E και αναλύθηκε σε μικροσκόπιο φωτός.Αντιπροσωπευτικές παθολογικές αλλαγές σε επτά τμήματα ιστού από επτά ανεξάρτητα ποντίκια αξιολογήθηκαν από έναν παθολόγο που δεν γνώριζε τη θεραπεία και καταγράφηκαν σε μεγέθυνση 200x.Το μήκος των λαχνών και το βάθος των κρυπτών μετρήθηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως.
Τα αποτελέσματα in vitro και in vivo ελήφθησαν εις τριπλούν.Τα γραφήματα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν με t-test, ενώ οι διαφορές μεταξύ ≥3 ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS (έκδοση 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ΗΠΑ).Τα δεδομένα αναλύθηκαν για την ομοιογένεια της διακύμανσης χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Levene που ακολουθείται από τη δοκιμασία post hoc του Bonferroni (Β).Η σημασία εκφράζεται ως Ρ<0,05, Ρ<0,01 και Ρ<0,001 (μη σημαντική [ns]) (Ρ>0,05).
Η προηγούμενη ανάλυσή μας της πρωτεομικής GEV στην Εγκυκλοπαίδεια Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG) έδειξε ότι πολλοί στόχοι μπορεί να εμπλέκονται στην ενεργοποίηση φλεγμονωδών οδών σηματοδότησης [13].Επιλέξαμε δύο πολλά υποσχόμενους στόχους, τις άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνες, ενισχύουμε αυτά τα μόρια και τα χρησιμοποιήσαμε για την κατασκευή του φορέα ευκαρυωτικής έκφρασης pcDNA3.1(+).Μετά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας, ανασυνδυασμένα πλασμίδια έκφρασης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνης επιμολύνθηκαν σε πρωτεύοντα περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού και ταυτοποιήθηκε η υπογραφή πρωτεΐνης κασπάσης-1 ρ20 της φλεγμονής (ένα θραύσμα ενεργοποιημένης κασπάσης-1). ως διασαφηνιστικά βασικά μόρια που μπορούν να προκαλέσουν φλεγμονή.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι άλφα-2 και άλφα-7,3 γιαρδίνες μπορούν να προκαλέσουν έκφραση ρ20 κασπάσης-1 παρόμοια με GEV.Δεν βρέθηκε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση της κασπάσης-1 στον μη επεξεργασμένο αρνητικό έλεγχο (μόνο PBS) και στον πλασμιδικό έλεγχο pcDNA3.1(+) (Εικόνα 1).
Μέτρηση της ενεργοποίησης της ρ20 κασπάσης-1 από pcDNA3.1(+)-άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνες.Ανασυνδυασμένα ευκαρυωτικά πλασμίδια έκφρασης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνες (πάνω από κάθε λωρίδα) επιμολύνθηκαν σε πρωτεύοντα περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού και τα υπερκείμενα της καλλιέργειας συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα.Χρησιμοποιήθηκε στύπωμα Western για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης φλεγμονώδους υπογραφής κασπάσης-1 ρ20.Η ομάδα θεραπείας μόνο με PBS (λωρίδα C) και η ομάδα μονοθεραπείας pcDNA3.1(+) (λωρίδα pcDNA3.1) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος και η ομάδα θεραπείας GEV χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.Η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με την ανίχνευση μιας ετικέτας ιστιδίνης σε κάθε πρωτεΐνη, και οι αναμενόμενες ζώνες πρωτεΐνης ήταν άλφα-2 γιαρδίνη (38,2 kDa) και άλφα-7,3 γιαρδίνη (37,2 kDa).GEV, Giardia δωδεκαδακτυλικά εξωκυτταρικά κυστίδια, pcDNA3.1(+), γραμμικός φορέας EcoRV, SUP, υπερκείμενο
Για να προσδιοριστεί εάν η άλφα-2 γιαρδίνη και η άλφα-7,3 γιαρδίνη επάγουν την έκφραση της ρ20 κασπάσης-1 και παίζουν ρόλο στην ενεργοποίηση της φλεγμονώδους απόκρισης NLRP3 του ξενιστή, η pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνη και η pcDNA3.1(+)-άλφα -7,3 γιαρδίνη επιμολύνθηκε σε πρωτεύοντα περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού με ανασυνδυασμένο πλασμιδικό DNA και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης, εντοπισμός και ολιγομερισμός των βασικών φλεγμονωδών πρωτεϊνών NLRP3.Σε αυτό το πείραμα, το GEV χρησιμοποιήθηκε ως η ομάδα θετικού ελέγχου και η ομάδα χωρίς θεραπεία (μόνο PBS) ή η ομάδα θεραπείας επιμόλυνσης pcDNA3.1(+) ήταν η αρνητική ομάδα.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, όπως και στην ομάδα GEV, το ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό DNA της γιαρδίνης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 και της γιαρδίνης pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 είχε ως αποτέλεσμα την ανοδική ρύθμιση των NLRP3, pro-IL-1β και ενεργοποίηση προκασπάσης-1 και κασπάσης-1 (Εικ. 2α).Επιπλέον, και οι δύο γιαρδίνες προκάλεσαν σημαντική έκκριση IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000· άλφα-2 γιαρδίνη: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;άλφα-7,3 γιαρδίνη: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Εικόνα 2β).Οι περισσότερες πρωτεΐνες ASC ήταν μονομερείς στην ομάδα χωρίς θεραπεία ή στην ομάδα θεραπείας που επιμολύνθηκε με το πλασμίδιο pcDNA3.1(+), σε αντίθεση με το pcDNA3.1(+)-άλφα-2 ή το pcDNA3.1(+)-άλφα- 7,3 γιαρντίνη.Ο ολιγομερισμός ASC έλαβε χώρα στο ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό DNA της ομάδας ή της ομάδας θετικού μάρτυρα GEV, που δείχνει μια ολιγομερική μορφή (Εικόνα 2c).Αυτά τα προκαταρκτικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι η άλφα-2 γιαρδίνη και η άλφα-7,3 γιαρδίνη μπορούν να προκαλέσουν ενεργοποίηση της φλεγμονής του NLRP3.Μεταγενέστερες μελέτες ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό των ASC και NLRP3 έδειξαν ότι στην ομάδα αρνητικού ελέγχου, η πρωτεΐνη ASC ήταν διασκορπισμένη σε όλο το κυτταρόπλασμα και εμφανίστηκε ως σήμα κουκκίδας κατά τη διέγερση του pcDNA3.1(+)-άλφα-2 με γιαρδίνη ή pcDNA3.Ομάδα 1(+)-άλφα-7,3 γιαρδίνης ή ομάδα θετικού ελέγχου GEV (Εικόνα 2δ).Στις ομάδες αρνητικού μάρτυρα και pcDNA 3.1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με πλασμίδιο, το σήμα πρωτεΐνης NLRP3 δεν ανιχνεύθηκε, ενώ μια φθορίζουσα κουκκίδα σήματος σε απόκριση στο pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνη ή το pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 εντοπίστηκε..giardine βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα ή κατά τη διέγερση του HEV (Εικ. 2e).Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν περαιτέρω ότι το G. duodenalis giardin alpha-2 και giardin alpha-7.3 ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 σε πρωτογενή περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού.
Το pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνη και το pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 γιαρδίνη ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 σε περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού.Μετατρέψτε τα ανασυνδυασμένα ευκαρυωτικά πλασμίδια έκφρασης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 giardin και pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin σε πρωτεύοντα περιτοναϊκά μακροφάγα και κύτταρα ποντικού ή συλλέξτε το υπερκείμενο εντός 24 ωρών για ανάλυση έκφρασης, ολιγομερισμό , έκκριση.και εντοπισμός βασικών φλεγμονωδών πρωτεϊνών.Η ομάδα PBS-μόνο (C) και η ομάδα απλής θεραπείας pcDNA3.1(+) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος και η ομάδα θεραπείας GEV χρησιμοποιήθηκε ως θετική ομάδα.α Οι βασικές φλεγμονώδεις πρωτεΐνες NLRP3, συμπεριλαμβανομένων των NLRP3, pro-IL-1β, προ-κασπάσης-1 και ρ20 κασπάσης-1, ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western.b Τα επίπεδα έκκρισης της IL-1β στα υπερκείμενα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA).Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ελέγχου και των πειραματικών ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS έκδοση 22.0.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων **P<0,01 και ***P<0,001.c Τα επίπεδα ολιγομερισμού ASC σε σφαιρίδια προσδιορίστηκαν με ανάλυση διασύνδεσης DSS, ενώ τα επίπεδα ASC σε κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης.δ Οπτικοποίηση εντοπισμού ISC με χρήση ανοσοφθορισμού.Ο ανοσοφθορισμός χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση του εντοπισμού του NLRP3.ASC, αποπτωτική πρωτεΐνη τύπου κηλίδας.IL, ιντερλευκίνη;NLRP3, υποδοχέας που μοιάζει με ολιγομερισμό που δεσμεύει νουκλεοτίδια 3;ns, μη σημαντικό (P > 0,05)
Τόσο το G. duodenalis όσο και τα GEV που εκκρίνει ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 και ρυθμίζουν τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις του ξενιστή in vitro.Έτσι, ο ρόλος του φλεγμονώδους NLRP3 στην παθογένεια του G. duodenalis παραμένει ασαφής.Για να διερευνήσουμε αυτό το ζήτημα, σχεδιάσαμε ένα πείραμα μεταξύ ποντικών που μολύνθηκαν με κύστη G. duodenalis και ποντικών που είχαν μολυνθεί με θεραπεία με κύστη G. duodenalis + αναστολέα MCC950 και συγκρίναμε την έκφραση φλεγμονώδους NLRP3 όταν μολύνθηκαν με κύστη G. duodenalis.Ένα λεπτομερές σχήμα του πειράματος φαίνεται στο Σχ. 3α.Οι αλλαγές στο σωματικό βάρος των ποντικών σε διαφορετικές ομάδες θεραπείας παρακολουθήθηκαν για 7 ημέρες μετά τη μόλυνση με κύστεις, και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 3β.Σε σύγκριση με την ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με καθαρό PBS, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι (i) το σωματικό βάρος των ποντικών που είχαν μολυνθεί με κύστη G. duodenalis μειώθηκε από την ημέρα 3 έως την ημέρα 7 μετά τη μόλυνση.(ii) η θεραπεία με τον αναστολέα MCC950 δεν είχε σημαντική επίδραση στο σωματικό βάρος των ποντικών..Σε σύγκριση με την ομάδα μεμονωμένης μόλυνσης, το BW της ομάδας λοίμωξης του δωδεκαδακτύλου που υποβλήθηκε σε θεραπεία με MCC950 μειώθηκε σε διάφορους βαθμούς (Ημέρα 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148· Ημέρα 2: ANOVA, F( 3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001; (3, 24)=0,6497, P=0,0645, Ημέρα 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το φλεγμονώδες NLRP3 προστατεύει τα ποντίκια από σημαντική απώλεια βάρους στα πρώιμα στάδια (2-4 ημέρες) της λοίμωξης του δωδεκαδακτύλου.Στη συνέχεια στοχεύσαμε στην ανίχνευση τροφοζωιτών G. duodenalis σε υγρό πλύσης δωδεκαδακτύλου και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3γ.Σε σύγκριση με την ομάδα μόλυνσης με κύστη G. duodenalis, ο αριθμός των τροφοζωιτών στο δωδεκαδάκτυλο αυξήθηκε σημαντικά μετά τον αποκλεισμό του φλεγμονώδους NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Οι ιστοί του δωδεκαδακτύλου που βάφτηκαν με HE έδειξαν, σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με PBS και MCC950 μόνο: (i) Η λοίμωξη από κύστη G. duodenalis οδήγησε σε βλάβη στις δωδεκαδακτυλικές λάχνες (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) και ατροφία της κρύπτης (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) δωδεκαδάκτυλο από ποντίκια μολυσμένα με κύστεις G. duodenalis και έλαβαν θεραπεία με αναστολείς MCC950.δωδεκαδακτυλικές λάχνες ήταν κατεστραμμένες και νεκρές (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) με ατροφία και διακλάδωση της κρύπτης (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Εικ. 3d- στ) .Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το φλεγμονώδες NLRP3 παίζει ρόλο στη μείωση της παθογένειας του G. duodenalis.
Ο ρόλος του φλεγμονώδους NLRP3 στη μόλυνση του δωδεκαδακτύλου Giardia.Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε καθετήρα (iv) με δωδεκαδακτυλοκοκκικές κύστεις και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς MCC950 (ip).Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ομάδες μονής θεραπείας με PBS ή MCC950.Πειραματική ομάδα και θεραπευτικό σχήμα.β Το σωματικό βάρος των ποντικών σε καθεμία από τις διάφορες ομάδες θεραπείας παρακολουθήθηκε για 7 ημέρες.Η διαφορά μεταξύ της ομάδας μόλυνσης από G. duodenalis και της ομάδας θεραπείας λοίμωξης από G. duodenalis + MCC950 αναλύθηκε με t-test χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS έκδοση 22.0.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές σε *P<0,05, **P<0,01 ή ***P<0,001.c Το παρασιτικό φορτίο προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των τροφοζωιτών στο υγρό πλύσης του δωδεκαδακτύλου.Η διαφορά μεταξύ της ομάδας μόλυνσης από G. duodenalis και της ομάδας θεραπείας λοίμωξης από G. duodenalis + MCC950 αναλύθηκε με t-test χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS έκδοση 22.0.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στο *P <0,05.δ Αποτελέσματα χρώσης αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η&Ε) της ιστοπαθολογίας του δωδεκαδακτύλου.Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν βλάβη στις λάχνες, τα πράσινα βέλη υποδηλώνουν βλάβη στις κρύπτες.Μπάρα κλίμακας: 100 μm.e, f Στατιστική ανάλυση ύψους δωδεκαδακτυλικής λάχνης και ύψους κρύπτης ποντικού.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές σε *P<0,05 και **P<0,01.Τα αποτελέσματα προέρχονται από 7 ανεξάρτητα βιολογικά πειράματα.BW, σωματικό βάρος;ig, οδός ενδογαστρικής παράδοσης.ip, οδός ενδοπεριτοναϊκής χορήγησης.ns, μη σημαντικό (P > 0,05);PBS, αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά;WT, άγριου τύπου
Η έκκριση της IL-1β είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης της φλεγμονής.Για να προσδιορίσουμε εάν η άλφα-2 γιαρδίνη G. duodenalis και η άλφα-7.3 γιαρδίνη ενεργοποιούν το φλεγμονώδες σώμα του ξενιστή NLRP3 in vivo, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια WT που δεν έλαβαν θεραπεία (ομάδα ψευδο) και ποντίκια αποκλεισμένα με φλεγμονές NLRP3 (ομάδα θεραπείας με αναστολή MCC950).Ένα λεπτομερές σχήμα του πειράματος φαίνεται στο Σχ. 4α.Οι πειραματικές ομάδες αποτελούνταν από ποντίκια που έλαβαν PBS, θεραπεία κύστης G. duodenalis με καθετήρα, ενδομυϊκή ένεση pcDNA3.1 και ενδομυϊκή ένεση pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνης ή pcDNA3.1-άλφα-7.3 γιαρδίνης.Την 7η ημέρα μετά την ενδομυϊκή χορήγηση του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου, συλλέχθηκε ορός και προσδιορίστηκε το επίπεδο της IL-1β σε κάθε ομάδα.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4β, στην ομάδα MOCK: (i) σε σύγκριση με την ομάδα PBS, η θεραπεία με pcDNA3.1 δεν είχε σημαντική επίδραση στην έκκριση IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), ωστόσο, Η έκκριση IL-β ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα κύστεων G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-άλφα-2 γιαρδίνη και pcDNA3.1- Η ενδομυϊκή ένεση άλφα-7,3 γιαρδίνης αύξησε σημαντικά τα επίπεδα IL-1β στον ορό (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001).(iii) Η pcDNA3.1-άλφα-7,3 γιαρδίνη προκάλεσε υψηλά επίπεδα έκκρισης IL-1β στην ομάδα ενδομυϊκής ένεσης pcDNA3.1-άλφα-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Σε σύγκριση με κάθε ομάδα στην ομάδα θεραπείας MCC950 και την ομάδα MOCK: (i) Τα επίπεδα έκκρισης IL-1β στην ομάδα ελέγχου PBS και στην ομάδα ελέγχου pcDNA3.1 μειώθηκαν σε κάποιο βαθμό μετά τον αποκλεισμό του αναστολέα MCC950, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) μετά τον αποκλεισμό του MCC950., η έκκριση IL-1β μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα που είχε μολυνθεί με κύστη G. duodenalis, στην ομάδα pcDNA3.1-άλφα-2 giardine και στην ομάδα pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-άλφα-2 γιαρδίνη: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-άλφα-7,3: ANOVA, F(; ) = 3,540, P = 0,0164).Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η άλφα-2 γιαρδίνη και η άλφα-7,3 γιαρδίνη μεσολαβούν στην ενεργοποίηση του φλεγμονώδους σώματος NLRP3 in vivo.
Οι pcDNA3.1(+)-γιαρδίνες ενεργοποιούν το φλεγμονώδες σώμα του ξενιστή NLRP3 in vivo.Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν (IM) με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ευκαρυωτικής έκφρασης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνη ή pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 γιαρδίνη και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με MCC950 (IP, ομάδα MCC950) ή όχι (εικονική ομάδα ).Η ομάδα θεραπείας με πλασμίδιο PBS ή pcDNA3.1(+) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, η ομάδα θεραπείας με κύστη G. duodenalis χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.Πειραματική ομάδα και θεραπευτικό σχήμα.b Τα επίπεδα ορού της IL-1β σε ποντικούς μετρήθηκαν την ημέρα 7 με δοκιμασία ELISA.Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων στην ομάδα MOCK αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και οι διαφορές μεταξύ της ομάδας MOCK και της ομάδας MCC950 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το t-test του λογισμικού SPSS έκδοση 22.0.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας στην ομάδα MOCK, *P<0,05 και ***P<0,001;Τα σύμβολα του δολαρίου ($) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ κάθε ομάδας στην ομάδα MOCK και της ομάδας MCC950 στο P<0,05.Αποτελέσματα επτά ανεξάρτητων βιολογικών πειραμάτων.i, ενδομυϊκή ένεση, ns, μη σημαντικό (P > 0,05)
Για τη διερεύνηση της επίδρασης της ενεργοποίησης του φλεγμονώδους ξενιστή NLRP3 που προκαλείται από άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνη στη μολυσματικότητα του G. duodenalis, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια WT C57BL/6 και εγχύαμε άλφα-2 γιαρδίνη και άλφα-7.3 γιαρδίνη.το πλασμίδιο εγχύθηκε ενδομυϊκά, μετά από 3 ημέρες μέσω του γαστρικού σωλήνα της κύστης G. duodenalis, μετά την οποία τα ποντίκια παρατηρήθηκαν για 7 ημέρες.Ένα λεπτομερές σχήμα του πειράματος φαίνεται στο Σχ. 5α.Το σωματικό βάρος κάθε ποντικού μετρήθηκε κάθε μέρα, συλλέχθηκαν δείγματα φρέσκου δωδεκαδακτυλικού ιστού την 7η ημέρα μετά τη χορήγηση μέσω γαστρικού σωλήνα, μετρήθηκε ο αριθμός των τροφοζωιτών και παρατηρήθηκαν ιστοπαθολογικές αλλαγές.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5β, με την αύξηση του χρόνου τροφοδοσίας, το ΣΒ των ποντικών σε κάθε ομάδα σταδιακά αυξήθηκε.Η MT των ποντικών άρχισε να μειώνεται την 3η ημέρα μετά την ενδογαστρική χορήγηση κύστεων G. duodenalis και στη συνέχεια αυξήθηκε σταδιακά.Η ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 που προκαλείται από ενδομυϊκή ένεση άλφα-2 γιαρδίνης και άλφα 7.3 γιαρδίνης μείωσε σημαντικά την απώλεια βάρους σε ποντικούς (Ημέρα 1: pcDNA3.1-άλφα-2 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Ημέρα 1: pcDNA3.1-άλφα-7.3 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Ημέρα 2: pcDNA3.1-άλφα-2 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, Ρ = 0,9979 Ημέρα 2: pcDNA3,1-άλφα-7,3 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, Ρ = 0,8409 Ημέρα 3: pcDNA3,1-άλφα-2, (ANOVA; 4, 30) = 0,8222, Ρ = 0,0262 Ημέρα 3: pcDNA3,1-άλφα-7,3 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, Ρ = 0,0083 Ημέρα 4: pcDNA3,1-άλφα-ΑΝΟΑ , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Ημέρα 4: pcDNA3,1-άλφα-7,3 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Ημέρα 5: pcDNA3,1-άλφα 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Ημέρα 5: pcDNA3,1-άλφα -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Ημέρα 6: pcDNA3. άλφα-2 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Ημέρα 6: pcDNA3,1-άλφα-7,3 γιαρδίνη, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Ημέρα 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Ημέρα 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0,0001).Το παρασιτικό φορτίο εκτιμήθηκε στο δωδεκαδάκτυλο (Εικ. 5γ).Σε σύγκριση με τον θετικό μάρτυρα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία και την ομάδα που έλαβε ένεση με τον άδειο φορέα pcDNA3.1, ο αριθμός των τροφοζωιτών G. duodenalis μειώθηκε σημαντικά στις ομάδες που έλαβαν α-2 γιαρδίνη και α-7,3 γιαρδίνη (pcDNA3.1-άλφα -2 γιαρδίνη: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-άλφα-7,3 γιαρδίνη: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Επιπλέον, η γιαρντίνη άλφα-7,3 ήταν πιο προστατευτική στα ποντίκια από τη γιαρντίνη άλφα-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Τα αποτελέσματα της χρώσης HE φαίνονται στο σχ.5d–f.Τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση άλφα-2 γιαρδίνης και άλφα-7,3 γιαρδίνης είχαν λιγότερες βλάβες ιστού δωδεκαδακτύλου, που εκδηλώθηκαν με βλάβη της λάχνης, σε σύγκριση με τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση G. duodenalis και τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση με G. duodenalis σε συνδυασμό με έναν κενό φορέα pcDNA3 .1 Zoom.(pcDNA3.1-άλφα-2 γιαρδίνη: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 ή P = 0.0068· pcDNA3.1-άλφα-7.3 γιαρδίνη: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 ή P = 0,0055) και μειωμένη ατροφία της κρύπτης (pcDNA3.1-άλφα-2 γιαρδίνη: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 ή P = 0.0158, pcDNA3.1-αλφα-αρδίνη: ΑΝΟ3. , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ή P = 0,0191).Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η άλφα-2 γιαρδίνη και η άλφα-7,3 γιαρδίνη μειώνουν τη μολυσματικότητα του G. duodenalis ενεργοποιώντας το φλεγμονώδες NLRP3 in vivo.
Ο ρόλος των pcDNA3.1(+)-γιαρδινών στη μόλυνση από G. duodenalis.Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν (ΙΜ) με ανασυνδυασμένα πλασμίδια ευκαρυωτικής έκφρασης pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνη ή pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 γιαρδίνη και στη συνέχεια προκλήθηκαν με κύστεις G. duodenalis (ig).Η ομάδα PBS και η ομάδα θεραπείας με pcDNA3.1(+) + δωδεκαδακτυλική κύστη χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδες αρνητικού ελέγχου και η ομάδα θεραπείας με κύστη δωδεκαδακτύλου χρησιμοποιήθηκε ως ομάδα θετικού ελέγχου.Πειραματική ομάδα και θεραπευτικό σχήμα.β Η ΜΤ των ποντικών σε καθεμία από τις διάφορες ομάδες θεραπείας παρακολουθήθηκε για 7 ημέρες μετά την πρόκληση.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων στην ομάδα G. duodenalis και στην ομάδα pcDNA3.1(+)-άλφα-2 giardine, *P <0,05, **P <0,01 και ***P <0,001.το σύμβολο του δολαρίου ($) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ κάθε ομάδας G. duodenalis και της ομάδας pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 jardine, $$P<0.01 και $$$P<0.001.γ Το παρασιτικό φορτίο προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των τροφοζωιτών σε 1 ml πλύσης δωδεκαδακτύλου από το δωδεκαδάκτυλο (μήκους 3 cm) και εκφράστηκε ως ο αριθμός των παρασίτων ανά cm του δωδεκαδακτύλου.Οι διαφορές μεταξύ της ομάδας μόλυνσης από G. duodenalis, της ομάδας pcDNA3.1(+)-άλφα-2 γιαρδίνης και της ομάδας pcDNA3.1(+)-άλφα-7.3 γιαρδίνης αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS έκδοση 22.0.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές σε **P<0,01 και ***P<0,001.δ Ιστοπαθολογικές αλλαγές στο δωδεκαδάκτυλο.Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν βλάβη στις λάχνες, τα πράσινα βέλη υποδηλώνουν βλάβη στις κρύπτες.Μπάρα κλίμακας: 100 μm.e, f Στατιστική ανάλυση ύψους δωδεκαδακτυλικής λάχνης ποντικού (e) και ύψους κρύπτης (f).Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων στο Σχήμα 1δ αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS έκδοση 22.0.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές σε *P<0,05 και **P<0,01.Αποτελέσματα επτά ανεξάρτητων βιολογικών πειραμάτων.ns, μη σημαντικό (P > 0,05)
Το δωδεκαδάκτυλο Giardia είναι ένα πολύ γνωστό εντερικό παράσιτο των ανθρώπων και άλλων θηλαστικών που προκαλεί γιαρδιάση.Το 2004, συμπεριλήφθηκε στην Πρωτοβουλία του ΠΟΥ για παραμελημένες ασθένειες λόγω του υψηλού επιπολασμού του σε διάστημα 6 ετών, ειδικά σε κοινότητες χαμηλής κοινωνικοοικονομικής κατάστασης [32].Το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανοσολογική απόκριση στη μόλυνση από G. duodenalis.Τα μακροφάγα ποντικού έχουν αναφερθεί ότι καταβροχθίζουν και σκοτώνουν το G. duodenalis απελευθερώνοντας εξωκυτταρικές παγίδες [33].Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι το G. duodenalis, ένα μη επεμβατικό εξωκυτταρικό παράσιτο, ενεργοποιεί τις φλεγμονώδεις οδούς σηματοδότησης p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 και NLRP3 σε μακροφάγους ποντικού για τη ρύθμιση των φλεγμονωδών αποκρίσεων του ξενιστή, και το GEV που απελευθερώνεται μπορεί να ενισχύσει αυτή τη διαδικασία.13], 24].Ωστόσο, τα ακριβή PAMP που εμπλέκονται στη φλεγμονή που ρυθμίζεται από το φλεγμονώδες NLRP3 στο GEV και ο ρόλος του φλεγμονώδους NLRP3 στη γιαρδιάση παραμένουν προς αποσαφήνιση.Για να ρίξουμε φως σε αυτά τα δύο ερωτήματα, πραγματοποιήσαμε αυτή τη μελέτη.
Το φλεγμονώδες NLRP3 βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του ανοσοποιητικού και μπορεί να ενεργοποιηθεί από διάφορα σωματίδια όπως κρύσταλλοι ουρικού οξέος, τοξίνες, βακτήρια, ιούς και παράσιτα.Σε βακτηριακές μελέτες, οι τοξίνες έχουν αναγνωριστεί ως βασικά PAMP που ενεργοποιούν τους φλεγμονώδεις αισθητήρες, οδηγώντας σε φλεγμονή και κυτταρικό θάνατο [34].Ορισμένες δομικά διαφορετικές τοξίνες, όπως η αιμολυσίνη από Staphylococcus aureus [35] και Escherichia coli [36], η αιμολυσίνη BL (HBL) από την εντεροτοξίνη (NHE) [37], επάγουν την ενεργοποίηση της φλεγμονής NLRP3.Οι ιογενείς μελέτες έχουν δείξει ότι οι λοιμώδεις πρωτεΐνες όπως η πρωτεΐνη φακέλου (Ε) SARS-COV-2 [38] και η πρωτεΐνη NS5 του ιού Zika [39] είναι σημαντικά PAMP που αναγνωρίζονται από τον υποδοχέα NLRP3.Σε μελέτες παρασίτων, πολλά παράσιτα έχουν αναφερθεί ότι σχετίζονται με την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους ξενιστή, όπως το Toxoplasma gondii, το Trichomonas vaginalis [40], το Trypanosoma cruzi [41] και η Leishmania [42].Οι πυκνές κοκκώδεις πρωτεΐνες GRA35, GRA42 και GRA43, που σχετίζονται με τη λοιμογόνο δράση του Toxoplasma gondii, απαιτούνται για την πρόκληση πυρόπτωσης σε μακροφάγα αρουραίων Lewis [43].Επιπλέον, ορισμένες μελέτες Leishmania έχουν επικεντρωθεί σε μεμονωμένα μόρια που εμπλέκονται στο φλεγμονώδες NLRP3, όπως η λιποφωσφογλυκάνη της μεμβράνης των παρασίτων [44] ή η μεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου [45].Μεταξύ της οικογένειας γονιδίων άλφα-γιαρδίνης που μοιάζει με αννεξίνη, η άλφα-1 γιαρδίνη έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα πιθανό υποψήφιο εμβόλιο που παρέχει προστασία έναντι του G. duodenalis σε ένα μοντέλο ποντικού [18].Στη μελέτη μας, επιλέξαμε τους παράγοντες λοιμογόνου δράσης του G. duodenalis άλφα-2 και άλφα-7,3 giardines, οι οποίοι είναι μοναδικοί για το giardia αλλά σχετικά λιγότερο αναφερόμενοι.Αυτά τα δύο γονίδια στόχοι κλωνοποιήθηκαν στον φορέα ευκαρυωτικού συστήματος έκφρασης pcDNA3.1(+) για ανάλυση ενεργοποίησης φλεγμονής.
Στο μοντέλο ποντικού μας, τα διασπασμένα θραύσματα κασπάσης χρησιμεύουν ως δείκτες φλεγμονώδους ενεργοποίησης.Κατά τη διέγερση, το NLRP3 αλληλεπιδρά με το ASC, στρατολογεί προκασπάσες και δημιουργεί ενεργές κασπάσες που διασπούν το pro-IL-1β και το pro-IL-18 σε ώριμα IL-1β και IL-18, αντίστοιχα -18.Οι φλεγμονώδεις κασπάσες (κασπάσες-1, -4, -5 και -11) είναι μια διατηρημένη οικογένεια πρωτεασών κυστεΐνης που είναι κρίσιμες για την έμφυτη άμυνα και εμπλέκονται στη φλεγμονή και στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [46].Η κασπάση-1 ενεργοποιείται από τα κανονικά φλεγμονοσώματα [47], ενώ οι κασπάσες-4, -5 και -11 διασπώνται κατά τον σχηματισμό άτυπων φλεγμονοσωμάτων [48].Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού ως μοντέλο και διερευνήσαμε την κασπάση-1 που διασπάστηκε από την ρ20 κασπάση-1 ως δείκτη ενεργοποίησης φλεγμονής του ξενιστή NLRP3 σε μελέτες μόλυνσης από G. duodenalis.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πολλές άλφα-γιαρδίνες είναι υπεύθυνες για την τυπική ενεργοποίηση της φλεγμονής, η οποία είναι σύμφωνη με την ανακάλυψη βασικών μολυσματικών μορίων που εμπλέκονται σε βακτήρια και ιούς.Ωστόσο, η μελέτη μας είναι μόνο μια προκαταρκτική εξέταση και υπάρχουν άλλα μόρια που μπορούν να ενεργοποιήσουν μη κλασικά φλεγμονοσώματα, καθώς η προηγούμενη μελέτη μας βρήκε τόσο κλασικά όσο και μη κλασικά φλεγμονοσώματα στη λοίμωξη από G. duodenalis [13].Για να προσδιορίσουμε περαιτέρω εάν η παραγόμενη ρ20 κασπάση-1 σχετίζεται με το φλεγμονώδες NLRP3, επιμολύναμε άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνες σε περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού για να προσδιορίσουμε τα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών βασικών μορίων και τα επίπεδα ολιγομερισμού ASC, επιβεβαιώνοντας ότι και οι δύο α-γιαρδίνες ενεργοποιούνται φλεγμονώδες NLRP3.Τα αποτελέσματά μας είναι ελαφρώς διαφορετικά από εκείνα των Manko-Prykhoda et al., που ανέφεραν ότι η διέγερση των κυττάρων Caco-2 με στελέχη EPEC G. muris ή E. coli από μόνα τους μπορεί να αυξήσει την ένταση φθορισμού των NLRP3, ASC και κασπάσης-1. αν και όχι σημαντικά, ενώ πώς η συνδιέγερση των G. muris και E. coli αύξησε τα επίπεδα τριών πρωτεϊνών [49].Αυτή η απόκλιση μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στην επιλογή των ειδών Giardia, των κυτταρικών γραμμών και των πρωτογενών κυττάρων.Πραγματοποιήσαμε επίσης in vivo προσδιορισμούς χρησιμοποιώντας MCC950 σε θηλυκά ποντίκια WT C57BL/6 ηλικίας 5 εβδομάδων, τα οποία είναι πιο ευαίσθητα στο G. duodenalis.Το MCC950 είναι ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας NLRP3 μικρού μορίου που εμποδίζει την κανονική και μη κανονική ενεργοποίηση του NLRP3 σε νανομοριακές συγκεντρώσεις.Το MCC950 αναστέλλει την ενεργοποίηση του NLRP3 αλλά δεν επηρεάζει την ενεργοποίηση των φλεγμονωδών οδών AIM2, NLRC4 και NLRP1 ή των οδών σηματοδότησης TLR [27].Το MCC950 εμποδίζει την ενεργοποίηση του NLRP3, αλλά δεν αναστέλλει την έναρξη του NLRP3, την εκροή K+, την εισροή Ca2+ ή την αλληλεπίδραση μεταξύ NLRP3 και ASC.Αντίθετα, αναστέλλει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 αναστέλλοντας τον ολιγομερισμό ASC [27].Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε το MCC950 σε μια in vivo μελέτη για να προσδιορίσουμε τον ρόλο του φλεγμονώδους NLRP3 μετά την ένεση giardine.Η ενεργοποιημένη κασπάση-1 ρ10 διασπά τις προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες pro-IL-1β και pro-IL-18 σε ώριμες IL-1β και IL-18 [50].Σε αυτή τη μελέτη, τα επίπεδα IL-1β στον ορό σε ποντίκια που έλαβαν γιαρδίνη με ή χωρίς MCC950 χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτης του εάν το φλεγμονώδες NLRP3 ενεργοποιήθηκε.Όπως αναμενόταν, η θεραπεία με MCC950 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα IL-1β στον ορό.Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ξεκάθαρα ότι το G. duodenalis giardin alfa-2 και giardin alfa-7.3 είναι ικανά να ενεργοποιήσουν το φλεγμονώδες σώμα ποντικού NLRP3.
Σημαντικά δεδομένα που συσσωρεύτηκαν την τελευταία δεκαετία έχουν δείξει ότι η IL-17A είναι ο κύριος ρυθμιστής της ανοσίας έναντι του G. muris, επάγοντας σηματοδότηση IL-17RA, παράγοντας αντιμικροβιακά πεπτίδια και ρυθμίζοντας την ενεργοποίηση του συμπληρώματος [51].Ωστόσο, η λοίμωξη Giardia εμφανίζεται συχνότερα σε νεαρούς ενήλικες και έχει αναφερθεί ότι η μόλυνση με Giardia σε νεαρά ποντίκια δεν ενεργοποιεί την απόκριση IL-17A για να ασκήσει την προστατευτική της δράση [52], ωθώντας τους ερευνητές να αναζητήσουν άλλα ανοσοτροποποιητικά Giardia.μηχανισμοί μόλυνσης από ελμινθικά.Οι συγγραφείς μιας πρόσφατης μελέτης ανέφεραν ότι το G. muris μπορεί να ενεργοποιήσει το φλεγμονώδες NLRP3 από το E. coli EPEC, το οποίο προάγει την παραγωγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων και μειώνει την ικανότητα προσκόλλησης και τον αριθμό των τροφοζωιτών στην εντερική οδό, μειώνοντας έτσι τη σοβαρότητα του παχέος εντέρου ασθένειες που προκαλούνται από βάκιλλους [49].Το φλεγμονώδες NLRP3 εμπλέκεται στην ανάπτυξη διαφόρων ασθενειών.Μελέτες έχουν δείξει ότι το Pseudomonas aeruginosa πυροδοτεί την αυτοφαγία στα μακροφάγα για να αποφευχθεί ο κυτταρικός θάνατος και αυτή η διαδικασία εξαρτάται από την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 [53].Για το N. caninum, η μεσολαβούμενη από αντιδραστικά είδη οξυγόνου ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 περιορίζει την αντιγραφή του στον ξενιστή, καθιστώντας το πιθανό θεραπευτικό στόχο [9].Το Paracoccidioides brasiliensis έχει βρεθεί ότι επάγει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 σε δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών ποντικού, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση της φλεγμονώδους κυτοκίνης IL-1β, η οποία παίζει κρίσιμο ρόλο στην άμυνα του ξενιστή [10].Αρκετά είδη Leishmania, συμπεριλαμβανομένων των L. amazonensis, L. major, L. braziliensis και L. infantum chagasi, ενεργοποιούν το NLRP3 και την εξαρτώμενη από το ASC κασπάση-1 σε μακροφάγα, καθώς και τη μόλυνση από Leishmania.Η αναπαραγωγή των παρασίτων ενισχύεται σε ποντίκια με έλλειψη του γονιδίου NLRP3/ASC/κασπάση-1 [11].Zamboni et al.Η λοίμωξη από Leishmania έχει αναφερθεί ότι προκαλεί ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 στα μακροφάγα, γεγονός που περιορίζει την αναπαραγωγή του ενδοκυτταρικού παρασίτου.Έτσι, η Leishmania μπορεί να αναστείλει την ενεργοποίηση του NLRP3 ως στρατηγική αποφυγής.Σε μελέτες in vivo, το φλεγμονώδες NLRP3 συνέβαλε στην εξάλειψη της Λεϊσμανίας, αλλά δεν επηρέασε τους ιστούς [54].Αντίθετα, σε μελέτες ελμινθίασης, η ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 κατέστειλε την προστατευτική ανοσία του ξενιστή έναντι της γαστρεντερικής ελμινθίασης [12].Η Shigella είναι ένα από τα κύρια βακτήρια που προκαλούν διάρροια παγκοσμίως.Αυτά τα βακτήρια μπορούν να προκαλέσουν παραγωγή IL-1β μέσω εκροής Κ+ που προκαλείται από τον υποδοχέα P2X7, αντιδραστικών ειδών οξυγόνου, λυσοσωμικής οξίνισης και μιτοχονδριακής βλάβης.Το φλεγμονώδες NLRP3 ρυθμίζει αρνητικά τη φαγοκυττάρωση και τη βακτηριοκτόνο δράση των μακροφάγων κατά της Shigella [55].Μελέτες με πλασμώδιο έχουν δείξει ότι τα ποντίκια με έλλειψη AIM2, NLRP3 ή κασπάσης-1 που έχουν μολυνθεί με Plasmodium παράγουν υψηλά επίπεδα ιντερφερόνης τύπου 1 και είναι πιο ανθεκτικά στη μόλυνση από πλασμώδιο [56].Ωστόσο, ο ρόλος της άλφα-2 γιαρδίνης και της άλφα-7,3 γιαρδίνης στην πρόκληση παθογόνου ενεργοποίησης της φλεγμονής του NLRP3 σε ποντίκια είναι ασαφής.
Σε αυτή τη μελέτη, η αναστολή του φλεγμονώδους NLRP3 από το MCC950 μείωσε το BW και αύξησε τον αριθμό των τροφοζωιτών στο υγρό εντερικής πλύσης σε ποντίκια, με αποτέλεσμα πιο σοβαρές παθολογικές αλλαγές στον ιστό του δωδεκαδακτύλου.Η άλφα-2 γιαρδίνη και η άλφα-7,3 γιαρδίνη ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 του ποντικού ξενιστή, αυξάνουν το σωματικό βάρος του ποντικού, μειώνουν τον αριθμό των τροφοζωιτών στο υγρό εντερικής πλύσης και ανακουφίζουν τις παθολογικές βλάβες του δωδεκαδακτύλου.Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το G. duodenalis μπορεί να ενεργοποιήσει το φλεγμονώδες σώμα του ξενιστή NLRP3 μέσω της άλφα-2 γιαρδίνης και της άλφα-7,3 γιαρδίνης, μειώνοντας την παθογένεια του G. duodenalis σε ποντικούς.
Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι οι άλφα-2 και άλφα-7.3 γιαρδίνες επάγουν την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους ξενιστή NLRP3 και μειώνουν τη μολυσματικότητα του G. duodenalis σε ποντικούς.Επομένως, αυτά τα μόρια είναι πολλά υποσχόμενοι στόχοι για την πρόληψη της γιαρδιάσης.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: μια επισκόπηση.Πρόσφατα αποκαλύφθηκε ότι ο Pat Inflamm είναι αλλεργικός στα φάρμακα.2019; 13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: μια ανασκόπηση της φαρμακοθεραπείας.Γνώμη πραγματογνωμοσύνης φαρμακοποιού.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, αντοχή στα φάρμακα και ανακάλυψη νέων στόχων.Προσβάλλει τους στόχους φαρμάκων Disord.2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, κλπ. NLRP3 φλεγμονώδεις και φλεγμονώδεις ασθένειες.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Ο ρόλος του φλεγμονώδους σώματος στην εντερική φλεγμονή και τον καρκίνο.Γαστρεντερολογία.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Κανονική και άτυπη ενεργοποίηση φλεγμονώδους NLRP3 στο σταυροδρόμι της ανοσολογικής ανοχής και της φλεγμονής του εντέρου.προ-άνοσο.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Η ενεργοποίηση φλεγμονώδους NLRP3 με τη μεσολάβηση ROS εμπλέκεται σε απόκριση στη μόλυνση από N. caninum.Παράσιτο διάνυσμα.2020; 13:449.