Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Οι φορείς γονιδίων για τη θεραπεία της πνευμονικής κυστικής ίνωσης πρέπει να στοχεύουν στους αγώγιμους αεραγωγούς, καθώς η περιφερική πνευμονική μεταγωγή δεν έχει θεραπευτικό αποτέλεσμα.Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής του ιού σχετίζεται άμεσα με το χρόνο παραμονής του φορέα.Ωστόσο, τα υγρά απελευθέρωσης όπως οι φορείς γονιδίων διαχέονται φυσικά στις κυψελίδες κατά την εισπνοή και τα θεραπευτικά σωματίδια οποιουδήποτε σχήματος απομακρύνονται ταχέως με τη μεταφορά του βλεννογόνου.Η παράταση του χρόνου παραμονής των φορέων γονιδίων στην αναπνευστική οδό είναι σημαντική αλλά δύσκολο να επιτευχθεί.Τα συζευγμένα με φορέα μαγνητικά σωματίδια που μπορούν να κατευθυνθούν στην επιφάνεια της αναπνευστικής οδού μπορούν να βελτιώσουν την περιφερειακή στόχευση.Λόγω προβλημάτων με την in vivo απεικόνιση, η συμπεριφορά τέτοιων μικρών μαγνητικών σωματιδίων στην επιφάνεια των αεραγωγών παρουσία ενός εφαρμοσμένου μαγνητικού πεδίου είναι ελάχιστα κατανοητή.Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να χρησιμοποιήσει την απεικόνιση σύγχροτρον για να απεικονίσει in vivo την κίνηση μιας σειράς μαγνητικών σωματιδίων στην τραχεία αναισθητοποιημένων αρουραίων προκειμένου να μελετήσει τη δυναμική και τα πρότυπα συμπεριφοράς μεμονωμένων και χύδην σωματιδίων in vivo.Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε επίσης εάν η παροχή μαγνητικών σωματιδίων φακοϊών παρουσία μαγνητικού πεδίου θα αύξανε την αποτελεσματικότητα της μεταγωγής στην τραχεία του αρουραίου.Η απεικόνιση ακτίνων Χ σύγχροτρον δείχνει τη συμπεριφορά των μαγνητικών σωματιδίων σε σταθερά και κινούμενα μαγνητικά πεδία in vitro και in vivo.Τα σωματίδια δεν μπορούν εύκολα να συρθούν στην επιφάνεια των ζωντανών αεραγωγών χρησιμοποιώντας μαγνήτες, αλλά κατά τη μεταφορά, οι εναποθέσεις συγκεντρώνονται στο οπτικό πεδίο, όπου το μαγνητικό πεδίο είναι ισχυρότερο.Η απόδοση της μεταγωγής αυξήθηκε επίσης έξι φορές όταν τα μαγνητικά σωματίδια φακοϊών απελευθερώθηκαν παρουσία μαγνητικού πεδίου.Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μαγνητικά σωματίδια και τα μαγνητικά πεδία των φακοϊών μπορεί να είναι πολύτιμες προσεγγίσεις για τη βελτίωση των επιπέδων στόχευσης γονιδιακού φορέα και μεταγωγής στους αγώγιμους αεραγωγούς in vivo.
Η κυστική ίνωση (CF) προκαλείται από παραλλαγές σε ένα μόνο γονίδιο που ονομάζεται ρυθμιστής διαμεμβρανικής αγωγιμότητας CF (CFTR).Η πρωτεΐνη CFTR είναι ένας δίαυλος ιόντων που υπάρχει σε πολλά επιθηλιακά κύτταρα σε όλο το σώμα, συμπεριλαμβανομένων των αεραγωγών, μια κύρια θέση στην παθογένεση της κυστικής ίνωσης.Τα ελαττώματα στο CFTR οδηγούν σε ανώμαλη μεταφορά νερού, αφυδάτωση της επιφάνειας των αεραγωγών και μειωμένο βάθος ρευστού στρώματος επιφανείας αεραγωγού (ASL).Επίσης βλάπτει την ικανότητα του συστήματος βλεννογονοειδούς μεταφοράς (MCT) να καθαρίζει τους αεραγωγούς από εισπνεόμενα σωματίδια και παθογόνα.Στόχος μας είναι να αναπτύξουμε μια γονιδιακή θεραπεία με φακοϊό (LV) για να παραδώσουμε το σωστό αντίγραφο του γονιδίου CFTR και να βελτιώσουμε την υγεία των ASL, MCT και των πνευμόνων και να συνεχίσουμε να αναπτύσσουμε νέες τεχνολογίες που μπορούν να μετρήσουν αυτές τις παραμέτρους in vivo1.
Οι φορείς LV είναι ένας από τους κορυφαίους υποψήφιους για γονιδιακή θεραπεία κυστικής ίνωσης, κυρίως επειδή μπορούν να ενσωματώσουν μόνιμα το θεραπευτικό γονίδιο στα βασικά κύτταρα των αεραγωγών (βλαστικά κύτταρα αεραγωγού).Αυτό είναι σημαντικό γιατί μπορούν να αποκαταστήσουν την κανονική ενυδάτωση και την κάθαρση της βλέννας διαφοροποιώντας σε λειτουργικά γονιδιακά διορθωμένα κύτταρα της επιφάνειας των αεραγωγών που σχετίζονται με την κυστική ίνωση, με αποτέλεσμα ισόβια οφέλη.Οι φορείς LV πρέπει να κατευθύνονται ενάντια στους αγώγιμους αεραγωγούς, καθώς εδώ αρχίζει η εμπλοκή των πνευμόνων στην ΚΙ.Η χορήγηση του φορέα βαθύτερα στον πνεύμονα μπορεί να οδηγήσει σε κυψελιδική μεταγωγή, αλλά αυτό δεν έχει θεραπευτικό αποτέλεσμα στην κυστική ίνωση.Ωστόσο, υγρά όπως οι φορείς γονιδίων μεταναστεύουν φυσικά στις κυψελίδες όταν εισπνέονται μετά τον τοκετό3,4 και τα θεραπευτικά σωματίδια αποβάλλονται ταχέως στη στοματική κοιλότητα από τα MCTs.Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής LV σχετίζεται άμεσα με το χρονικό διάστημα που ο φορέας παραμένει κοντά στα κύτταρα-στόχους για να επιτρέψει την κυτταρική πρόσληψη - «χρόνος παραμονής» 5 που συντομεύεται εύκολα από την τυπική περιφερειακή ροή αέρα καθώς και τη συντονισμένη πρόσληψη βλέννας και σωματιδίων MCT.Για την κυστική ίνωση, η ικανότητα παράτασης του χρόνου παραμονής της LV στους αεραγωγούς είναι σημαντική για την επίτευξη υψηλών επιπέδων μεταγωγής σε αυτήν την περιοχή, αλλά μέχρι στιγμής ήταν προκλητική.
Για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο, προτείνουμε ότι τα μαγνητικά σωματίδια LV (MPs) μπορούν να βοηθήσουν με δύο συμπληρωματικούς τρόπους.Πρώτον, μπορούν να καθοδηγηθούν από έναν μαγνήτη στην επιφάνεια των αεραγωγών για να βελτιώσουν τη στόχευση και να βοηθήσουν τα σωματίδια του φορέα γονιδίων να βρίσκονται στη σωστή περιοχή του αεραγωγού.και ASL) μετακινούνται στο κυτταρικό στρώμα 6. Τα MPs χρησιμοποιούνται ευρέως ως στοχευμένα οχήματα χορήγησης φαρμάκων όταν συνδέονται με αντισώματα, φάρμακα χημειοθεραπείας ή άλλα μικρά μόρια που προσκολλώνται στις κυτταρικές μεμβράνες ή συνδέονται με τους αντίστοιχους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας τους και συσσωρεύονται σε θέσεις όγκου στο παρουσία στατικού ηλεκτρισμού.Μαγνητικά πεδία για θεραπεία καρκίνου 7. Άλλες «υπερθερμικές» μέθοδοι στοχεύουν στη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων με θέρμανση των MP όταν εκτίθενται σε ταλαντευόμενα μαγνητικά πεδία.Η αρχή της μαγνητικής διαμόλυνσης, στην οποία ένα μαγνητικό πεδίο χρησιμοποιείται ως παράγοντας μορφομετατροπής για την ενίσχυση της μεταφοράς του DNA στα κύτταρα, χρησιμοποιείται συνήθως in vitro χρησιμοποιώντας μια σειρά μη ιικών και ιικών γονιδιακών φορέων για δύσκολες στη μεταγωγή κυτταρικές σειρές ..Η αποτελεσματικότητα της μαγνητομετατροπής LV με την παροχή LV MP in vitro σε μια κυτταρική σειρά ανθρώπινου βρογχικού επιθηλίου παρουσία στατικού μαγνητικού πεδίου, καθιερώθηκε, αυξάνοντας την αποτελεσματικότητα της μεταγωγής κατά 186 φορές σε σύγκριση με τον φορέα LV μόνο.Το LV MT έχει επίσης εφαρμοστεί σε ένα in vitro μοντέλο κυστικής ίνωσης, όπου η μαγνητική επιμόλυνση αύξησε τη μεταγωγή της LV σε καλλιέργειες διεπαφής αέρα-υγρού κατά έναν παράγοντα 20 παρουσία πτυέλων κυστικής ίνωσης10.Ωστόσο, η in vivo μαγνητομετατροπή οργάνων έχει λάβει σχετικά μικρή προσοχή και έχει αξιολογηθεί μόνο σε λίγες μελέτες σε ζώα11,12,13,14,15, ειδικά στους πνεύμονες16,17.Ωστόσο, οι δυνατότητες μαγνητικής επιμόλυνσης στην πνευμονοθεραπεία στην κυστική ίνωση είναι σαφείς.Οι Tan et al.(2020) δήλωσε ότι «μια μελέτη επικύρωσης για την αποτελεσματική πνευμονική παροχή μαγνητικών νανοσωματιδίων θα ανοίξει το δρόμο για μελλοντικές στρατηγικές εισπνοής CFTR για τη βελτίωση των κλινικών αποτελεσμάτων σε ασθενείς με κυστική ίνωση»6.
Η συμπεριφορά των μικρών μαγνητικών σωματιδίων στην επιφάνεια της αναπνευστικής οδού παρουσία εφαρμοσμένου μαγνητικού πεδίου είναι δύσκολο να οπτικοποιηθεί και να μελετηθεί, και ως εκ τούτου είναι ελάχιστα κατανοητές.Σε άλλες μελέτες, έχουμε αναπτύξει μια μέθοδο απεικόνισης ακτίνων Χ με αντίθεση φάσης με βάση τη διάδοση Synchrotron (PB-PCXI) για μη επεμβατική απεικόνιση και ποσοτικό προσδιορισμό λεπτών in vivo αλλαγών στο βάθος ASL18 και στη συμπεριφορά MCT19,20 για την άμεση μέτρηση της ενυδάτωσης στην επιφάνεια του καναλιού αερίου και χρησιμοποιείται ως πρώιμος δείκτης αποτελεσματικότητας της θεραπείας.Επιπλέον, η μέθοδος βαθμολόγησης MCT χρησιμοποιεί σωματίδια διαμέτρου 10–35 μm που αποτελούνται από αλουμίνα ή γυαλί υψηλού δείκτη διάθλασης ως δείκτες MCT ορατούς με το PB-PCXI21.Και οι δύο μέθοδοι είναι κατάλληλες για την απεικόνιση μιας σειράς τύπων σωματιδίων, συμπεριλαμβανομένων των MP.
Λόγω της υψηλής χωρικής και χρονικής ανάλυσης, οι δοκιμασίες ASL και MCT που βασίζονται σε PB-PCXI είναι κατάλληλες για τη μελέτη της δυναμικής και των μοτίβων συμπεριφοράς μεμονωμένων και χύδην σωματιδίων in vivo για να μας βοηθήσουν να κατανοήσουμε και να βελτιστοποιήσουμε τις μεθόδους χορήγησης γονιδίων MP.Η προσέγγιση που χρησιμοποιούμε εδώ βασίζεται στις μελέτες μας χρησιμοποιώντας τη γραμμή δέσμης SPring-8 BL20B2, στην οποία οπτικοποιήσαμε την κίνηση του υγρού μετά την παράδοση μιας δόσης ενός εικονικού φορέα στους ρινικούς και πνευμονικούς αεραγωγούς των ποντικών για να εξηγήσουμε τα ετερογενή μοτίβα γονιδιακής έκφρασης που παρατηρήθηκαν στο γονίδιο μας.μελέτες σε ζώα με δόση φορέα 3,4 .
Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να χρησιμοποιήσει το σύγχροτρο PB-PCXI για να απεικονίσει in vivo κινήσεις μιας σειράς MPs στην τραχεία ζωντανών αρουραίων.Αυτές οι μελέτες απεικόνισης PB-PCXI σχεδιάστηκαν για να δοκιμάσουν τη σειρά MP, την ένταση του μαγνητικού πεδίου και τη θέση για να καθορίσουν την επίδρασή τους στην κίνηση MP.Υποθέσαμε ότι ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο θα βοηθούσε το παραδιδόμενο MF να παραμείνει ή να μετακινηθεί στην περιοχή στόχο.Αυτές οι μελέτες μας επέτρεψαν επίσης να προσδιορίσουμε διαμορφώσεις μαγνητών που μεγιστοποιούν την ποσότητα των σωματιδίων που μένουν στην τραχεία μετά την εναπόθεση.Σε μια δεύτερη σειρά μελετών, στοχεύσαμε να χρησιμοποιήσουμε αυτή τη βέλτιστη διαμόρφωση για να δείξουμε το πρότυπο μεταγωγής που προκύπτει από την in vivo παροχή LV-MPs στους αεραγωγούς του αρουραίου, με την υπόθεση ότι η χορήγηση LV-MPs στο πλαίσιο της στόχευσης των αεραγωγών θα είχε ως αποτέλεσμα σε αυξημένη απόδοση μεταγωγής LV..
Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με πρωτόκολλα που έχουν εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο της Αδελαΐδας (M-2019-060 και M-2020-022) και την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων Synchrotron SPring-8.Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του ARRIVE.
Όλες οι εικόνες ακτίνων Χ λήφθηκαν στη γραμμή δέσμης BL20XU στο σύγχροτρο SPring-8 στην Ιαπωνία χρησιμοποιώντας μια ρύθμιση παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως21,22.Εν συντομία, το πειραματικό κουτί εντοπίστηκε 245 m από τον δακτύλιο αποθήκευσης σύγχροτρον.Μια απόσταση δείγματος-ανιχνευτή 0,6 m χρησιμοποιείται για μελέτες απεικόνισης σωματιδίων και 0,3 m για in vivo μελέτες απεικόνισης για τη δημιουργία εφέ αντίθεσης φάσης.Χρησιμοποιήθηκε μονοχρωματική δέσμη με ενέργεια 25 keV.Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας έναν μετατροπέα ακτίνων Χ υψηλής ανάλυσης (SPring-8 BM3) συνδεδεμένο με έναν ανιχνευτή sCMOS.Ο μορφοτροπέας μετατρέπει τις ακτίνες Χ σε ορατό φως χρησιμοποιώντας έναν σπινθηριστή πάχους 10 μm (Gd3Al2Ga3O12), ο οποίος στη συνέχεια κατευθύνεται στον αισθητήρα sCMOS χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό μικροσκόπιο ×10 (NA 0.3).Ο ανιχνευτής sCMOS ήταν ένα Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Ιαπωνία) με μέγεθος διάταξης 2048 × 2048 εικονοστοιχεία και μέγεθος πρωτογενούς εικονοστοιχείου 6,5 × 6,5 μm.Αυτή η ρύθμιση δίνει ένα αποτελεσματικό μέγεθος ισοτροπικού εικονοστοιχείου 0,51 μm και ένα οπτικό πεδίο περίπου 1,1 mm × 1,1 mm.Η διάρκεια έκθεσης των 100 ms επιλέχθηκε για να μεγιστοποιήσει την αναλογία σήματος προς θόρυβο των μαγνητικών σωματιδίων εντός και εκτός των αεραγωγών, ελαχιστοποιώντας ταυτόχρονα τα τεχνουργήματα κίνησης που προκαλούνται από την αναπνοή.Για in vivo μελέτες, ένα γρήγορο κλείστρο ακτίνων Χ τοποθετήθηκε στη διαδρομή ακτίνων Χ για να περιοριστεί η δόση ακτινοβολίας εμποδίζοντας τη δέσμη ακτίνων Χ μεταξύ των εκθέσεων.
Το μέσο LV δεν χρησιμοποιήθηκε σε καμία μελέτη απεικόνισης SPring-8 PB-PCXI, επειδή ο θάλαμος απεικόνισης BL20XU δεν είναι πιστοποιημένος Βιοασφάλεια Επίπεδο 2.Αντίθετα, επιλέξαμε μια σειρά καλά χαρακτηρισμένων MP από δύο εμπορικούς προμηθευτές που καλύπτουν μια σειρά μεγεθών, υλικών, συγκεντρώσεων σιδήρου και εφαρμογών , — πρώτα για να κατανοήσουμε πώς τα μαγνητικά πεδία επηρεάζουν την κίνηση των MP στα γυάλινα τριχοειδή αγγεία και στη συνέχεια ζωντανούς αεραγωγούς.επιφάνεια.Το μέγεθος του MP ποικίλλει από 0,25 έως 18 μm και είναι κατασκευασμένο από διάφορα υλικά (βλ. Πίνακα 1), αλλά η σύνθεση κάθε δείγματος, συμπεριλαμβανομένου του μεγέθους των μαγνητικών σωματιδίων στο MP, είναι άγνωστη.Με βάση τις εκτεταμένες μελέτες MCT μας 19, 20, 21, 23, 24, αναμένουμε ότι MPs έως 5 μm μπορούν να φανούν στην επιφάνεια της τραχειακού αεραγωγού, για παράδειγμα, αφαιρώντας διαδοχικά πλαίσια για να δούμε βελτιωμένη ορατότητα της κίνησης MP.Ένα μόνο MP 0,25 μm είναι μικρότερο από την ανάλυση της συσκευής απεικόνισης, αλλά το PB-PCXI αναμένεται να ανιχνεύσει την ογκομετρική τους αντίθεση και την κίνηση του επιφανειακού υγρού στο οποίο εναποτίθενται μετά την απόθεσή τους.
Δείγματα για κάθε βουλευτή στον πίνακα.Το 1 παρασκευάστηκε σε γυάλινα τριχοειδή 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) με εσωτερική διάμετρο 0,63 mm.Τα σωματίδια σωματιδίων είναι διαθέσιμα στο νερό, ενώ τα σωματίδια CombiMag είναι διαθέσιμα στο ιδιόκτητο υγρό του κατασκευαστή.Κάθε σωληνάριο είναι κατά το ήμισυ γεμάτο με υγρό (περίπου 11 μl) και τοποθετείται στη θήκη δείγματος (βλ. Εικόνα 1).Τα γυάλινα τριχοειδή τοποθετήθηκαν οριζόντια στη σκηνή στον θάλαμο απεικόνισης, αντίστοιχα, και τοποθετήθηκαν στις άκρες του υγρού.Ένας μαγνήτης από κέλυφος νικελίου διαμέτρου 19 mm (μήκους 28 mm) από σπάνια γη, νεοδύμιο, σίδηρο και βόριο (NdFeB) (N35, αρ. κατ. LM1652, Jaycar Electronics, Αυστραλία) με κατάλοιπο 1,17 Τ προσαρτήθηκε σε ξεχωριστός πίνακας μεταφοράς για επίτευξη Αλλάξτε τη θέση σας εξ αποστάσεως κατά την απόδοση.Η απεικόνιση με ακτίνες Χ ξεκινά όταν ο μαγνήτης τοποθετηθεί περίπου 30 mm πάνω από το δείγμα και οι εικόνες λαμβάνονται με ταχύτητα 4 καρέ ανά δευτερόλεπτο.Κατά τη διάρκεια της απεικόνισης, ο μαγνήτης φέρθηκε κοντά στον γυάλινο τριχοειδές σωλήνα (σε απόσταση περίπου 1 mm) και στη συνέχεια μετακινήθηκε κατά μήκος του σωλήνα για να εκτιμηθεί η επίδραση της έντασης του πεδίου και της θέσης.
Μια διάταξη απεικόνισης in vitro που περιέχει δείγματα MP σε γυάλινα τριχοειδή στο στάδιο της μετάφρασης του δείγματος xy.Η διαδρομή της δέσμης ακτίνων Χ σημειώνεται με μια κόκκινη διακεκομμένη γραμμή.
Μόλις διαπιστώθηκε η in vitro ορατότητα των MPs, ένα υποσύνολο από αυτά δοκιμάστηκε in vivo σε θηλυκούς αρουραίους Wistar αλμπίνο άγριου τύπου (~12 εβδομάδων, ~200 g).Μεδετομιδίνη 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), μιδαζολάμη 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) και βουτορφανόλη 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με μίγμα Pharma (Ιαπωνία) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση.Μετά την αναισθησία, προετοιμάστηκαν για απεικόνιση αφαιρώντας τη γούνα γύρω από την τραχεία, εισάγοντας έναν ενδοτραχειακό σωλήνα (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT) και ακινητοποιώντας τους σε ύπτια θέση σε ειδική πλάκα απεικόνισης που περιείχε θερμική σακούλα. για τη διατήρηση της θερμοκρασίας του σώματος.22. Η πλάκα απεικόνισης στη συνέχεια προσαρτήθηκε στο στάδιο του δείγματος στο πλαίσιο απεικόνισης υπό ελαφρά γωνία για να ευθυγραμμιστεί η τραχεία οριζόντια στην εικόνα ακτίνων Χ όπως φαίνεται στην Εικόνα 2α.
(α) Ρύθμιση απεικόνισης in vivo στη μονάδα απεικόνισης SPring-8, διαδρομή δέσμης ακτίνων Χ σημειωμένη με κόκκινη διακεκομμένη γραμμή.(β, γ) Ο εντοπισμός μαγνήτη τραχείας πραγματοποιήθηκε εξ αποστάσεως χρησιμοποιώντας δύο ορθογώνια τοποθετημένες κάμερες IP.Στην αριστερή πλευρά της εικόνας στην οθόνη, μπορείτε να δείτε τον συρμάτινο βρόχο που συγκρατεί την κεφαλή και τον σωληνίσκο παροχής που είναι εγκατεστημένος μέσα στο σωλήνα ET.
Ένα σύστημα αντλίας σύριγγας με τηλεχειρισμό (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) που χρησιμοποιεί γυάλινη σύριγγα 100 μl συνδέθηκε σε σωλήνα PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) χρησιμοποιώντας βελόνα 30 Ga.Σημαδέψτε το σωληνάριο για να βεβαιωθείτε ότι το άκρο βρίσκεται στη σωστή θέση στην τραχεία κατά την εισαγωγή του ενδοτραχειακού σωλήνα.Χρησιμοποιώντας μια μικροαντλία, το έμβολο της σύριγγας αφαιρέθηκε και η άκρη του σωλήνα βυθίστηκε στο δείγμα MP που θα παραδοθεί.Ο φορτωμένος σωλήνας χορήγησης στη συνέχεια εισήχθη στον ενδοτραχειακό σωλήνα, τοποθετώντας το άκρο στο ισχυρότερο μέρος του αναμενόμενου εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου.Η λήψη εικόνας ελεγχόταν χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή αναπνοής συνδεδεμένο στο κιβώτιο χρονισμού που βασίζεται στο Arduino και όλα τα σήματα (π.χ. θερμοκρασία, αναπνοή, άνοιγμα/κλείσιμο κλείστρου και λήψη εικόνας) καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας το Powerlab και το LabChart (AD Instruments, Sydney, Αυστραλία) 22 Κατά την απεικόνιση Όταν το περίβλημα δεν ήταν διαθέσιμο, δύο κάμερες IP (Panasonic BB-SC382) τοποθετήθηκαν σε περίπου 90° μεταξύ τους και χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της θέσης του μαγνήτη σε σχέση με την τραχεία κατά την απεικόνιση (Εικόνα 2β, γ).Για να ελαχιστοποιηθούν τα τεχνουργήματα κίνησης, λήφθηκε μία εικόνα ανά αναπνοή κατά τη διάρκεια της τελικής αναπνευστικής ροής.
Ο μαγνήτης είναι προσαρτημένος στο δεύτερο στάδιο, το οποίο μπορεί να βρίσκεται απομακρυσμένα στο εξωτερικό του σώματος απεικόνισης.Δοκιμάστηκαν διάφορες θέσεις και διαμορφώσεις του μαγνήτη, όπως: τοποθετημένος σε γωνία περίπου 30° πάνω από την τραχεία (οι διαμορφώσεις φαίνονται στα Σχήματα 2α και 3α).ο ένας μαγνήτης πάνω από το ζώο και ο άλλος κάτω, με τους πόλους ρυθμισμένους για έλξη (Εικόνα 3β)., ένας μαγνήτης πάνω από το ζώο και ένας κάτω, με τους πόλους ρυθμισμένους για απώθηση (Εικόνα 3γ), και έναν μαγνήτη πάνω και κάθετο στην τραχεία (Εικόνα 3δ).Μετά τη ρύθμιση του ζώου και του μαγνήτη και τη φόρτωση του υπό δοκιμή MP στην αντλία σύριγγας, χορηγήστε μια δόση 50 μl με ρυθμό 4 μl/sec κατά τη λήψη εικόνων.Ο μαγνήτης στη συνέχεια μετακινείται εμπρός και πίσω κατά μήκος ή κατά μήκος της τραχείας ενώ συνεχίζει να αποκτά εικόνες.
Διαμόρφωση μαγνήτη για in vivo απεικόνιση (α) ένας μαγνήτης πάνω από την τραχεία υπό γωνία περίπου 30°, (β) δύο μαγνήτες διαμορφωμένοι για έλξη, (γ) δύο μαγνήτες διαμορφωμένοι για απώθηση, (δ) ένας μαγνήτης πάνω και κάθετοι στο τραχεία.Ο παρατηρητής κοίταξε κάτω από το στόμα στους πνεύμονες μέσω της τραχείας και η ακτίνα Χ πέρασε από την αριστερή πλευρά του αρουραίου και έβγαινε από τη δεξιά πλευρά.Ο μαγνήτης είτε μετακινείται κατά μήκος του αεραγωγού είτε αριστερά και δεξιά πάνω από την τραχεία προς την κατεύθυνση της δέσμης ακτίνων Χ.
Επιδιώξαμε επίσης να προσδιορίσουμε την ορατότητα και τη συμπεριφορά των σωματιδίων στους αεραγωγούς απουσία ανάμειξης της αναπνοής και του καρδιακού ρυθμού.Ως εκ τούτου, στο τέλος της περιόδου απεικόνισης, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ανθρώπινη ευθανασία λόγω υπερβολικής δόσης πεντοβαρβιτάλης (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, ΗΠΑ, ~65 mg/kg ενδοπεριτοναϊκώς).Μερικά ζώα αφέθηκαν στην πλατφόρμα απεικόνισης και μετά τη διακοπή της αναπνοής και του καρδιακού παλμού, η διαδικασία απεικόνισης επαναλήφθηκε, προσθέτοντας μια επιπλέον δόση MP εάν δεν ήταν ορατό MP στην επιφάνεια των αεραγωγών.
Οι εικόνες που προέκυψαν διορθώθηκαν για επίπεδο και σκοτεινό πεδίο και στη συνέχεια συγκεντρώθηκαν σε μια ταινία (20 καρέ ανά δευτερόλεπτο, 15–25 × κανονική ταχύτητα ανάλογα με τον ρυθμό αναπνοής) χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο σενάριο γραμμένο σε MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Όλες οι μελέτες σχετικά με την παροχή φορέως γονιδίου LV διεξήχθησαν στο Εργαστηριακό Κέντρο Έρευνας Ζώων του Πανεπιστημίου της Αδελαΐδας και είχαν ως στόχο να χρησιμοποιήσουν τα αποτελέσματα του πειράματος SPring-8 για να αξιολογήσουν εάν η παροχή LV-MP παρουσία μαγνητικού πεδίου θα μπορούσε να ενισχύσει τη μεταφορά γονιδίων in vivo .Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις του MF και του μαγνητικού πεδίου, υποβλήθηκαν σε θεραπεία δύο ομάδες ζώων: στη μία ομάδα εγχύθηκε LV MF με τοποθέτηση μαγνήτη και στην άλλη ομάδα έγινε ένεση με μια ομάδα ελέγχου με LV MF χωρίς μαγνήτη.
Φορείς γονιδίου LV έχουν δημιουργηθεί χρησιμοποιώντας μεθόδους 25, 26 που περιγράφηκαν προηγουμένως.Ο φορέας LacZ εκφράζει ένα πυρηνικό εντοπισμένο γονίδιο βήτα-γαλακτοσιδάσης που καθοδηγείται από τον συστατικό προαγωγέα MPSV (LV-LacZ), ο οποίος παράγει ένα μπλε προϊόν αντίδρασης σε κύτταρα που έχουν υποστεί μεταγωγή, ορατό σε μέτωπα και τμήματα πνευμονικού ιστού.Η τιτλοδότηση πραγματοποιήθηκε σε κυτταροκαλλιέργειες μετρώντας χειροκίνητα τον αριθμό των LacZ-θετικών κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο για τον υπολογισμό του τίτλου σε TU/ml.Οι φορείς κρυοσυντηρούνται στους -80°C, αποψύχονται πριν από τη χρήση και δεσμεύονται στο CombiMag με ανάμειξη 1:1 και επώαση σε πάγο για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την παράδοση.
Κανονικοί αρουραίοι Sprague Dawley (n = 3/ομάδα, ~2-3 αναισθητοποιημένοι ενδοπεριτοναϊκοί με μείγμα 0,4 mg/kg μεδετομιδίνης (Domitor, Ilium, Αυστραλία) και 60 mg/kg κεταμίνης (Ilium, Αυστραλία) σε ηλικία 1 μηνός) ip ) ένεση και μη χειρουργική στοματική σωλήνωση με ενδοφλέβιο σωληνίσκο 16 Ga.Για να εξασφαλιστεί ότι ο ιστός του τραχειακού αεραγωγού λαμβάνει μεταγωγή LV, ρυθμίστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο μηχανικής διαταραχής που περιγράφηκε προηγουμένως στο οποίο η επιφάνεια του αεραγωγού της τραχείας τρίβονταν αξονικά με ένα συρμάτινο καλάθι (N-Circle, εξαγωγέας πέτρας νιτινόλης χωρίς άκρη NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Στη συνέχεια, περίπου 10 λεπτά μετά τη διαταραχή στον θάλαμο βιοασφάλειας, πραγματοποιήθηκε χορήγηση LV-MP στην τραχεία.
Το μαγνητικό πεδίο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πείραμα διαμορφώθηκε παρόμοια με μια in vivo μελέτη ακτίνων Χ, με τους ίδιους μαγνήτες που συγκρατούνται πάνω από την τραχεία με σφιγκτήρες στεντ απόσταξης (Εικόνα 4).Ένας όγκος 50 μΐ (2 x 25 μΐ κλάσματα) LV-MP χορηγήθηκε στην τραχεία (n = 3 ζώα) χρησιμοποιώντας μια πιπέτα με μύτη με πήκτωμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως.Η ομάδα ελέγχου (n = 3 ζώα) έλαβε το ίδιο LV-MP χωρίς τη χρήση μαγνήτη.Μετά την ολοκλήρωση της έγχυσης, ο σωληνίσκος αφαιρείται από τον ενδοτραχειακό σωλήνα και το ζώο αποσωληνώνεται.Ο μαγνήτης παραμένει στη θέση του για 10 λεπτά πριν αφαιρεθεί.Οι αρουραίοι δόθηκαν υποδόρια με μελοξικάμη (1 ml/kg) (Ilium, Αυστραλία) ακολουθούμενη από διακοπή της αναισθησίας με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 1 mg/kg υδροχλωρικής ατιπαμαζόλης (Antisedan, Zoetis, Αυστραλία).Οι αρουραίοι διατηρήθηκαν ζεστοί και παρακολουθήθηκαν μέχρι την πλήρη ανάρρωση από την αναισθησία.
Συσκευή παράδοσης LV-MP σε ντουλάπι βιολογικής ασφάλειας.Μπορείτε να δείτε ότι το ανοιχτό γκρι χιτώνιο Luer-lock του σωλήνα ET προεξέχει από το στόμα και το άκρο της πιπέτας γέλης που φαίνεται στο σχήμα εισάγεται μέσω του σωλήνα ET στο επιθυμητό βάθος στην τραχεία.
Μία εβδομάδα μετά τη διαδικασία χορήγησης LV-MP, τα ζώα θυσιάστηκαν ανθρώπινα με εισπνοή 100% CO2 και η έκφραση LacZ αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την τυπική μας θεραπεία X-gal.Οι τρεις πιο ουραίοι χόνδροι δακτύλιοι αφαιρέθηκαν για να διασφαλιστεί ότι οποιαδήποτε μηχανική βλάβη ή κατακράτηση υγρών λόγω τοποθέτησης ενδοτραχειακού σωλήνα δεν θα συμπεριληφθεί στην ανάλυση.Κάθε τραχεία κόπηκε κατά μήκος για να ληφθούν δύο μισά για ανάλυση και τοποθετήθηκε σε ένα κύπελλο που περιείχε καουτσούκ σιλικόνης (Sylgard, Dow Inc) χρησιμοποιώντας μια βελόνα Minutien (Fine Science Tools) για να οπτικοποιηθεί η επιφάνεια του αυλού.Η κατανομή και ο χαρακτήρας των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε μεταγωγή επιβεβαιώθηκαν με μετωπική φωτογραφία χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Nikon (SMZ1500) με κάμερα DigiLite και λογισμικό TCapture (Tucsen Photonics, Κίνα).Οι εικόνες λήφθηκαν σε μεγέθυνση 20x (συμπεριλαμβανομένης της μέγιστης ρύθμισης για το πλήρες πλάτος της τραχείας), με όλο το μήκος της τραχείας να εμφανίζεται βήμα προς βήμα, παρέχοντας αρκετή επικάλυψη μεταξύ κάθε εικόνας ώστε να επιτρέπεται η «ράψιμο» των εικόνων.Οι εικόνες από κάθε τραχεία στη συνέχεια συνδυάστηκαν σε μια ενιαία σύνθετη εικόνα χρησιμοποιώντας το Composite Image Editor έκδοση 2.0.3 (Microsoft Research) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο επίπεδης κίνησης. Η περιοχή έκφρασης LacZ εντός των σύνθετων εικόνων της τραχείας από κάθε ζώο ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σενάριο MATLAB (R2020a, MathWorks) όπως περιγράφηκε προηγουμένως28, χρησιμοποιώντας ρυθμίσεις 0,35 < Απόχρωση < 0,58, Κορεσμός > 0,15 και Τιμή < 0,7. Η περιοχή έκφρασης του LacZ εντός των σύνθετων εικόνων της τραχείας από κάθε ζώο ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σενάριο MATLAB (R2020a, MathWorks) όπως περιγράφηκε προηγουμένως28, χρησιμοποιώντας ρυθμίσεις 0,35 < Απόχρωση < 0,58, Κορεσμός > 0,15 και Τιμή < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях τραχεи от каждого животного была количествено προσδιορισµένο µε τη χρήση της αυτοµατοποιηµένης σκηνής MATLAB (R2020a, MathWorks), ως опис на <5,28, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Η περιοχή έκφρασης του LacZ σε σύνθετες εικόνες τραχείας από κάθε ζώο ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σενάριο MATLAB (R2020a, MathWorks) όπως περιγράφηκε προηγουμένως28 χρησιμοποιώντας ρυθμίσεις 0,350,15 και τιμή<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复脚气管复合合自自进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 ισχίο……………. Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животно количественно определяли со использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, со искористување <5,000 0,15 και σημασία <0,7 . Οι περιοχές έκφρασης LacZ σε σύνθετες εικόνες της τραχείας κάθε ζώου ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σενάριο MATLAB (R2020a, MathWorks) όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας ρυθμίσεις 0,35 < απόχρωση < 0,58, κορεσμό > 0,15 και τιμή < 0,7 .Παρακολουθώντας τα περιγράμματα του ιστού στο GIMP v2.10.24, δημιουργήθηκε χειροκίνητα μια μάσκα για κάθε σύνθετη εικόνα για την αναγνώριση της περιοχής του ιστού και την πρόληψη τυχόν ψευδών ανιχνεύσεων έξω από τον ιστό της τραχείας.Οι χρωματισμένες περιοχές από όλες τις σύνθετες εικόνες από κάθε ζώο αθροίστηκαν για να δώσουν τη συνολική χρωματισμένη περιοχή για αυτό το ζώο.Στη συνέχεια, η βαμμένη περιοχή διαιρέθηκε με τη συνολική επιφάνεια της μάσκας για να ληφθεί μια κανονικοποιημένη περιοχή.
Κάθε τραχεία ενσωματώθηκε σε παραφίνη και τεμαχίστηκε πάχους 5 μm.Οι τομές αντιχρωματίστηκαν με ουδέτερο γρήγορο κόκκινο για 5 λεπτά και οι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Nikon Eclipse E400, κάμερα DS-Fi3 και λογισμικό λήψης στοιχείων NIS (έκδοση 5.20.00).
Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Η στατιστική σημασία ορίστηκε σε p ≤ 0,05.Η κανονικότητα δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Shapiro-Wilk και οι διαφορές στη χρώση LacZ αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μη ζευγαρωμένη t-test.
Τα έξι MPs που περιγράφονται στον Πίνακα 1 εξετάστηκαν με PCXI και η ορατότητα περιγράφεται στον Πίνακα 2. Δύο MPs πολυστυρενίου (MP1 και MP2, 18 µm και 0,25 µm, αντίστοιχα) δεν ήταν ορατά από το PCXI, αλλά τα υπόλοιπα δείγματα μπορούσαν να αναγνωριστούν (παραδείγματα φαίνονται στο Σχήμα 5).Τα MP3 και MP4 είναι ασθενώς ορατά (10-15% Fe3O4, 0,25 µm και 0,9 µm, αντίστοιχα).Αν και το MP5 (98% Fe3O4, 0,25 µm) περιείχε μερικά από τα μικρότερα σωματίδια που δοκιμάστηκαν, ήταν το πιο έντονο.Το προϊόν CombiMag MP6 είναι δύσκολο να διακριθεί.Σε όλες τις περιπτώσεις, η ικανότητά μας να ανιχνεύουμε MFs βελτιώθηκε σημαντικά μετακινώντας τον μαγνήτη εμπρός και πίσω παράλληλα με το τριχοειδές.Καθώς οι μαγνήτες απομακρύνθηκαν από το τριχοειδές, τα σωματίδια τραβήχτηκαν έξω σε μακριές αλυσίδες, αλλά καθώς οι μαγνήτες πλησίαζαν και η ισχύς του μαγνητικού πεδίου αυξανόταν, οι αλυσίδες σωματιδίων βραχύνονταν καθώς τα σωματίδια μεταναστεύουν προς την άνω επιφάνεια του τριχοειδούς (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S1 : MP4), αυξάνοντας την πυκνότητα των σωματιδίων στην επιφάνεια.Αντίθετα, όταν ο μαγνήτης αφαιρείται από το τριχοειδές, η ένταση του πεδίου μειώνεται και τα MPs αναδιατάσσονται σε μακριές αλυσίδες που εκτείνονται από την επάνω επιφάνεια του τριχοειδούς (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S2: MP4).Αφού ο μαγνήτης σταματήσει να κινείται, τα σωματίδια συνεχίζουν να κινούνται για κάποιο χρονικό διάστημα αφού φτάσουν στη θέση ισορροπίας.Καθώς το MP κινείται προς και μακριά από την άνω επιφάνεια του τριχοειδούς, τα μαγνητικά σωματίδια τείνουν να τραβούν υπολείμματα μέσα από το υγρό.
Η ορατότητα του MP κάτω από το PCXI ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων.(α) MP3, (β) MP4, (γ) MP5 και (δ) MP6.Όλες οι εικόνες που εμφανίζονται εδώ τραβήχτηκαν με μαγνήτη τοποθετημένο περίπου 10 mm ακριβώς πάνω από το τριχοειδές.Οι φαινομενικά μεγάλοι κύκλοι είναι φυσαλίδες αέρα παγιδευμένες στα τριχοειδή αγγεία, δείχνοντας ξεκάθαρα τα ασπρόμαυρα χαρακτηριστικά των άκρων της εικόνας αντίθεσης φάσης.Το κόκκινο πλαίσιο υποδεικνύει τη μεγέθυνση που ενισχύει την αντίθεση.Σημειώστε ότι οι διάμετροι των κυκλωμάτων μαγνητών σε όλα τα σχήματα δεν είναι σε κλίμακα και είναι περίπου 100 φορές μεγαλύτερες από ό,τι φαίνεται.
Καθώς ο μαγνήτης κινείται αριστερά και δεξιά κατά μήκος της κορυφής του τριχοειδούς, η γωνία της σειράς MP αλλάζει για να ευθυγραμμιστεί με τον μαγνήτη (βλ. Εικόνα 6), οριοθετώντας έτσι τις γραμμές του μαγνητικού πεδίου.Για MP3-5, αφού η χορδή φτάσει στη γωνία κατωφλίου, τα σωματίδια σύρονται κατά μήκος της άνω επιφάνειας του τριχοειδούς.Αυτό συχνά έχει ως αποτέλεσμα τα MPs να ομαδοποιούνται σε μεγαλύτερες ομάδες κοντά στο σημείο όπου το μαγνητικό πεδίο είναι ισχυρότερο (βλ. Συμπληρωματικό βίντεο S3: MP5).Αυτό είναι επίσης ιδιαίτερα εμφανές κατά την απεικόνιση κοντά στο άκρο του τριχοειδούς, γεγονός που αναγκάζει το MP να συσσωρεύεται και να συγκεντρώνεται στη διεπαφή υγρού-αέρα.Τα σωματίδια στο MP6, τα οποία ήταν πιο δύσκολο να διακριθούν από εκείνα του MP3-5, δεν σύρθηκαν όταν ο μαγνήτης κινήθηκε κατά μήκος του τριχοειδούς, αλλά οι χορδές MP διασπάστηκαν, αφήνοντας τα σωματίδια να φαίνονται (δείτε το συμπληρωματικό βίντεο S4: MP6).Σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν το εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο μειώθηκε μετακινώντας τον μαγνήτη σε μεγάλη απόσταση από το σημείο απεικόνισης, τυχόν εναπομείναντες MPs κατέβηκαν αργά στην κάτω επιφάνεια του σωλήνα λόγω της βαρύτητας, παραμένοντας στη χορδή (δείτε Συμπληρωματικό βίντεο S5: MP3) .
Η γωνία της χορδής MP αλλάζει καθώς ο μαγνήτης κινείται προς τα δεξιά πάνω από το τριχοειδές.(α) MP3, (β) MP4, (γ) MP5 και (δ) MP6.Το κόκκινο πλαίσιο υποδεικνύει τη μεγέθυνση που ενισχύει την αντίθεση.Λάβετε υπόψη ότι τα πρόσθετα βίντεο προορίζονται για ενημερωτικούς σκοπούς, καθώς αποκαλύπτουν σημαντική δομή σωματιδίων και δυναμικές πληροφορίες που δεν μπορούν να απεικονιστούν σε αυτές τις στατικές εικόνες.
Οι δοκιμές μας έδειξαν ότι η αργή κίνηση του μαγνήτη εμπρός και πίσω κατά μήκος της τραχείας διευκολύνει την απεικόνιση του MF στο πλαίσιο της σύνθετης κίνησης in vivo.Δεν πραγματοποιήθηκαν δοκιμές in vivo επειδή τα σφαιρίδια πολυστυρενίου (MP1 και MP2) δεν ήταν ορατά στο τριχοειδές.Καθένα από τα υπόλοιπα τέσσερα MF δοκιμάστηκε in vivo με τον μακρύ άξονα του μαγνήτη τοποθετημένο πάνω από την τραχεία σε γωνία περίπου 30° προς την κατακόρυφο (βλ. Σχήματα 2b και 3a), καθώς αυτό είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερες αλυσίδες MF και ήταν πιο αποτελεσματικό παρά ένας μαγνήτης..η διαμόρφωση τερματίστηκε.MP3, MP4 και MP6 δεν έχουν βρεθεί στην τραχεία κανενός ζωντανού ζώου.Όταν οραματιζόταν την αναπνευστική οδό των αρουραίων μετά τη θανάτωση των ζώων, τα σωματίδια παρέμειναν αόρατα ακόμη και όταν προστέθηκε επιπλέον όγκος χρησιμοποιώντας μια αντλία σύριγγας.Το MP5 είχε την υψηλότερη περιεκτικότητα σε οξείδιο του σιδήρου και ήταν το μόνο ορατό σωματίδιο, επομένως χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση και τον χαρακτηρισμό της συμπεριφοράς MP in vivo.
Η τοποθέτηση του μαγνήτη πάνω από την τραχεία κατά την εισαγωγή MF είχε ως αποτέλεσμα πολλά, αλλά όχι όλα, MF να συγκεντρωθούν στο οπτικό πεδίο.Η είσοδος σωματιδίων στην τραχεία παρατηρείται καλύτερα σε ζώα που έχουν υποστεί ανθρώπινη ευθανασία.Εικόνα 7 και συμπληρωματικό βίντεο S6: Το MP5 δείχνει ταχεία μαγνητική σύλληψη και ευθυγράμμιση σωματιδίων στην επιφάνεια της κοιλιακής τραχείας, υποδεικνύοντας ότι τα MPs μπορούν να στοχευθούν στις επιθυμητές περιοχές της τραχείας.Κατά την αναζήτηση πιο απομακρυσμένα κατά μήκος της τραχείας μετά την παράδοση MF, ορισμένα MF βρέθηκαν πιο κοντά στην καρίνα, γεγονός που υποδηλώνει ανεπαρκή ισχύ μαγνητικού πεδίου για τη συλλογή και συγκράτηση όλων των MFs, καθώς χορηγήθηκαν μέσω της περιοχής μέγιστης ισχύος μαγνητικού πεδίου κατά τη χορήγηση υγρού.επεξεργάζομαι, διαδικασία.Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις MP μετά τη γέννηση ήταν υψηλότερες γύρω από την περιοχή της εικόνας, υποδηλώνοντας ότι πολλά MPs παρέμειναν στις περιοχές των αεραγωγών όπου η ένταση του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου ήταν υψηλότερη.
Εικόνες (α) πριν και (β) μετά την παράδοση του MP5 στην τραχεία ενός πρόσφατα ευθανατισμένου αρουραίου με έναν μαγνήτη τοποθετημένο ακριβώς πάνω από την περιοχή απεικόνισης.Η απεικονιζόμενη περιοχή βρίσκεται ανάμεσα σε δύο χόνδρινους δακτυλίους.Υπάρχει λίγο υγρό στους αεραγωγούς πριν από την παράδοση του MP.Το κόκκινο πλαίσιο υποδεικνύει τη μεγέθυνση που ενισχύει την αντίθεση.Αυτές οι εικόνες προέρχονται από το βίντεο που εμφανίζεται στο S6: MP5 Supplementary Video.
Η μετακίνηση του μαγνήτη κατά μήκος της τραχείας in vivo είχε ως αποτέλεσμα μια αλλαγή στη γωνία της αλυσίδας MP στην επιφάνεια των αεραγωγών, παρόμοια με αυτή που παρατηρείται στα τριχοειδή αγγεία (βλ. Εικόνα 8 και Συμπληρωματικό Βίντεο S7: MP5).Ωστόσο, στη μελέτη μας, τα MPs δεν μπορούσαν να συρθούν κατά μήκος της επιφάνειας των ζωντανών αναπνευστικών οδών, όπως θα μπορούσαν να κάνουν τα τριχοειδή.Σε ορισμένες περιπτώσεις, η αλυσίδα MP επιμηκύνεται καθώς ο μαγνήτης κινείται αριστερά και δεξιά.Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε επίσης ότι η αλυσίδα σωματιδίων αλλάζει το βάθος του επιφανειακού στρώματος του ρευστού όταν ο μαγνήτης μετακινείται διαμήκως κατά μήκος της τραχείας και διαστέλλεται όταν ο μαγνήτης μετακινείται απευθείας από πάνω και η αλυσίδα σωματιδίων περιστρέφεται σε κατακόρυφη θέση (βλ. Συμπληρωματικό βίντεο S7).: MP5 στο 0:09, κάτω δεξιά).Το χαρακτηριστικό μοτίβο κίνησης άλλαξε όταν ο μαγνήτης μετακινήθηκε πλευρικά στην κορυφή της τραχείας (δηλαδή, αριστερά ή δεξιά του ζώου, αντί κατά μήκος της τραχείας).Τα σωματίδια εξακολουθούσαν να είναι ορατά κατά τη διάρκεια της κίνησής τους, αλλά όταν ο μαγνήτης αφαιρέθηκε από την τραχεία, οι άκρες των χορδών των σωματιδίων έγιναν ορατές (δείτε το Συμπληρωματικό Βίντεο S8: MP5, ξεκινώντας από το 0:08).Αυτό συμφωνεί με την παρατηρούμενη συμπεριφορά του μαγνητικού πεδίου υπό τη δράση ενός εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου σε ένα γυάλινο τριχοειδές.
Δείγματα εικόνων που δείχνουν MP5 στην τραχεία ενός ζωντανού αναισθητοποιημένου αρουραίου.(α) Ο μαγνήτης χρησιμοποιείται για τη λήψη εικόνων πάνω και αριστερά από την τραχεία, στη συνέχεια (β) αφού μετακινηθεί ο μαγνήτης προς τα δεξιά.Το κόκκινο πλαίσιο υποδεικνύει τη μεγέθυνση που ενισχύει την αντίθεση.Αυτές οι εικόνες είναι από το βίντεο που παρουσιάζεται στο συμπληρωματικό βίντεο του S7: MP5.
Όταν οι δύο πόλοι συντονίστηκαν σε προσανατολισμό βορρά-νότου πάνω και κάτω από την τραχεία (δηλαδή, έλξη· Εικ. 3β), οι χορδές MP εμφανίστηκαν μακρύτερες και βρίσκονταν στο πλευρικό τοίχωμα της τραχείας και όχι στη ραχιαία επιφάνεια της τραχείας. τραχεία (βλ. Παράρτημα).Βίντεο S9:MP5).Ωστόσο, υψηλές συγκεντρώσεις σωματιδίων σε ένα σημείο (δηλαδή, στη ραχιαία επιφάνεια της τραχείας) δεν ανιχνεύθηκαν μετά τη χορήγηση υγρού με χρήση συσκευής διπλού μαγνήτη, που συνήθως εμφανίζεται με μια συσκευή ενός μόνο μαγνήτη.Στη συνέχεια, όταν ένας μαγνήτης διαμορφώθηκε για να απωθεί τους αντίθετους πόλους (Εικόνα 3γ), ο αριθμός των σωματιδίων ορατών στο οπτικό πεδίο δεν αυξήθηκε μετά την παράδοση.Η ρύθμιση και των δύο διαμορφώσεων μαγνητών είναι πρόκληση λόγω της υψηλής έντασης μαγνητικού πεδίου που προσελκύει ή ωθεί τους μαγνήτες αντίστοιχα.Η διάταξη στη συνέχεια άλλαξε σε έναν μόνο μαγνήτη παράλληλο με τους αεραγωγούς, αλλά περνώντας μέσα από τους αεραγωγούς υπό γωνία 90 μοιρών, έτσι ώστε οι γραμμές δύναμης να διέσχιζαν το τοίχωμα της τραχείας ορθογώνια (Εικόνα 3δ), ένας προσανατολισμός που προορίζεται να καθορίσει την πιθανότητα συσσωμάτωσης σωματιδίων σε το πλευρικό τοίχωμα.να παρατηρηθεί.Ωστόσο, σε αυτή τη διαμόρφωση, δεν υπήρχε καμία αναγνωρίσιμη κίνηση συσσώρευσης MF ή κίνηση μαγνήτη.Με βάση όλα αυτά τα αποτελέσματα, επιλέχθηκε μια διαμόρφωση με έναν μόνο μαγνήτη και έναν προσανατολισμό 30 μοιρών για in vivo μελέτες φορέων γονιδίων (Εικ. 3a).
Όταν το ζώο απεικονίστηκε πολλές φορές αμέσως μετά την ανθρώπινη θυσία, η απουσία παρεμβαλλόμενης κίνησης ιστού σήμαινε ότι μπορούσαν να διακριθούν λεπτότερες, μικρότερες γραμμές σωματιδίων στο διαυγές μεσοχόνδρινο πεδίο, «ταλαντευόμενοι» σύμφωνα με τη μεταφορική κίνηση του μαγνήτη.δείτε ξεκάθαρα την παρουσία και την κίνηση των σωματιδίων MP6.
Ο τίτλος του LV-LacZ ήταν 1,8 x 108 IU/mL και μετά από ανάμειξη 1:1 με CombiMag MP (MP6), στα ζώα ενέθηκαν 50 μl δόσης τραχείας 9 x 107 IU/ml φορέα LV (δηλ. 4,5 x 106 TU/αρουραίος).).).Σε αυτές τις μελέτες, αντί να μετακινήσουμε τον μαγνήτη κατά τη διάρκεια του τοκετού, στερεώσαμε τον μαγνήτη σε μία θέση για να προσδιορίσουμε εάν η μεταγωγή LV θα μπορούσε (α) να βελτιωθεί σε σύγκριση με τη μεταφορά του φορέα απουσία μαγνητικού πεδίου και (β) εάν ο αεραγωγός θα μπορούσε να είστε συγκεντρωμένοι.Τα κύτταρα μετατρέπονται στις μαγνητικές περιοχές-στόχους της ανώτερης αναπνευστικής οδού.
Η παρουσία μαγνητών και η χρήση του CombiMag σε συνδυασμό με φορείς LV δεν φάνηκε να επηρεάζει αρνητικά την υγεία των ζώων, όπως και το τυπικό μας πρωτόκολλο παράδοσης φορέα LV.Οι μετωπικές εικόνες της περιοχής της τραχείας που υποβλήθηκε σε μηχανική διαταραχή (Συμπληρωματικό Σχήμα 1) έδειξαν ότι η ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με LV-MP είχε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα μεταγωγής παρουσία μαγνήτη (Εικ. 9a).Μόνο μια μικρή ποσότητα μπλε χρώσης LacZ υπήρχε στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 9β).Η ποσοτικοποίηση των κανονικοποιημένων περιοχών που χρωματίστηκαν με X-Gal έδειξε ότι η χορήγηση LV-MP παρουσία μαγνητικού πεδίου είχε ως αποτέλεσμα περίπου 6 φορές βελτίωση (Εικ. 9c).
Παράδειγμα σύνθετων εικόνων που δείχνουν μεταγωγή τραχείας με LV-MP (α) παρουσία μαγνητικού πεδίου και (β) απουσία μαγνήτη.(γ) Στατιστικά σημαντική βελτίωση στην κανονικοποιημένη περιοχή της μεταγωγής LacZ στην τραχεία με τη χρήση μαγνήτη (*p = 0,029, t-test, n = 3 ανά ομάδα, μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου).
Ουδέτερες τομές με ταχεία κόκκινη χρώση (το παράδειγμα φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 2) έδειξαν ότι κύτταρα χρωματισμένα με LacZ υπήρχαν στο ίδιο δείγμα και στην ίδια θέση όπως αναφέρθηκε προηγουμένως.
Η βασική πρόκληση στη γονιδιακή θεραπεία των αεραγωγών παραμένει ο ακριβής εντοπισμός των σωματιδίων φορέα σε περιοχές ενδιαφέροντος και η επίτευξη υψηλού επιπέδου αποτελεσματικότητας μεταγωγής στον κινητό πνεύμονα παρουσία ροής αέρα και ενεργού κάθαρσης βλέννας.Για τους φορείς LV που προορίζονται για τη θεραπεία αναπνευστικών ασθενειών στην κυστική ίνωση, η αύξηση του χρόνου παραμονής των σωματιδίων φορέα στους αγώγιμους αεραγωγούς ήταν μέχρι τώρα ένας ανέφικτος στόχος.Όπως επισημαίνεται από τους Castellani et al., η χρήση μαγνητικών πεδίων για την ενίσχυση της μεταγωγής έχει πλεονεκτήματα έναντι άλλων μεθόδων παροχής γονιδίων όπως η ηλεκτροδιάτρηση, επειδή μπορεί να συνδυάσει απλότητα, οικονομία, τοπική παροχή, αυξημένη απόδοση και μικρότερο χρόνο επώασης.και πιθανώς χαμηλότερη δόση οχήματος10.Ωστόσο, η in vivo εναπόθεση και συμπεριφορά μαγνητικών σωματιδίων στους αεραγωγούς υπό την επίδραση εξωτερικών μαγνητικών δυνάμεων δεν έχει ποτέ περιγραφεί, και στην πραγματικότητα η ικανότητα αυτής της μεθόδου να αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης γονιδίων σε ανέπαφους ζωντανούς αεραγωγούς δεν έχει αποδειχθεί in vivo.
Τα πειράματά μας in vitro στο σύγχροτρο PCXI έδειξαν ότι όλα τα σωματίδια που δοκιμάσαμε, με εξαίρεση το πολυστυρένιο MP, ήταν ορατά στη διάταξη απεικόνισης που χρησιμοποιήσαμε.Με την παρουσία ενός μαγνητικού πεδίου, τα μαγνητικά πεδία σχηματίζουν χορδές, το μήκος των οποίων σχετίζεται με τον τύπο των σωματιδίων και την ισχύ του μαγνητικού πεδίου (δηλαδή την εγγύτητα και την κίνηση του μαγνήτη).Όπως φαίνεται στο Σχήμα 10, οι χορδές που παρατηρούμε σχηματίζονται καθώς κάθε μεμονωμένο σωματίδιο μαγνητίζεται και προκαλεί το δικό του τοπικό μαγνητικό πεδίο.Αυτά τα χωριστά πεδία αναγκάζουν άλλα παρόμοια σωματίδια να συλλέγονται και να συνδέονται με ομαδικές κινήσεις χορδών λόγω τοπικών δυνάμεων από τις τοπικές δυνάμεις έλξης και απώθησης άλλων σωματιδίων.
Διάγραμμα που δείχνει (α, β) αλυσίδες σωματιδίων που σχηματίζονται μέσα σε τριχοειδή αγγεία γεμάτα υγρό και (γ, δ) μια τραχεία γεμάτη αέρα.Σημειώστε ότι τα τριχοειδή αγγεία και η τραχεία δεν έλκονται σε κλίμακα.Το πλαίσιο (α) περιέχει επίσης μια περιγραφή του MF που περιέχει σωματίδια Fe3O4 διατεταγμένα σε αλυσίδες.
Όταν ο μαγνήτης μετακινήθηκε πάνω από το τριχοειδές, η γωνία της χορδής των σωματιδίων έφτασε το κρίσιμο όριο για το MP3-5 που περιέχει Fe3O4, μετά το οποίο η χορδή σωματιδίων δεν παρέμεινε πλέον στην αρχική της θέση, αλλά μετακινήθηκε κατά μήκος της επιφάνειας σε μια νέα θέση.μαγνήτης.Αυτό το φαινόμενο πιθανότατα συμβαίνει επειδή η επιφάνεια του γυάλινου τριχοειδούς είναι αρκετά ομαλή ώστε να επιτρέπεται αυτή η κίνηση.Είναι ενδιαφέρον ότι το MP6 (CombiMag) δεν συμπεριφέρθηκε με αυτόν τον τρόπο, ίσως επειδή τα σωματίδια ήταν μικρότερα, είχαν διαφορετική επικάλυψη ή επιφανειακό φορτίο ή το ιδιόκτητο φέρον υγρό επηρέασε την ικανότητά τους να κινούνται.Η αντίθεση στην εικόνα των σωματιδίων CombiMag είναι επίσης πιο αδύναμη, υποδηλώνοντας ότι το υγρό και τα σωματίδια μπορεί να έχουν την ίδια πυκνότητα και επομένως δεν μπορούν εύκολα να κινηθούν το ένα προς το άλλο.Τα σωματίδια μπορούν επίσης να κολλήσουν εάν ο μαγνήτης κινείται πολύ γρήγορα, υποδεικνύοντας ότι η ισχύς του μαγνητικού πεδίου δεν μπορεί πάντα να υπερνικήσει την τριβή μεταξύ των σωματιδίων στο ρευστό, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ισχύς του μαγνητικού πεδίου και η απόσταση μεταξύ του μαγνήτη και της περιοχής στόχου δεν πρέπει να είναι έκπληξη.σπουδαίος.Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν επίσης ότι αν και οι μαγνήτες μπορούν να συλλάβουν πολλά μικροσωματίδια που ρέουν μέσα από την περιοχή στόχο, είναι απίθανο να βασιστεί κανείς στους μαγνήτες για να μετακινήσει τα σωματίδια CombiMag κατά μήκος της επιφάνειας της τραχείας.Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι οι in vivo μελέτες LV MF θα πρέπει να χρησιμοποιούν στατικά μαγνητικά πεδία για τη φυσική στόχευση συγκεκριμένων περιοχών του δέντρου αεραγωγού.
Μόλις τα σωματίδια παραδοθούν στο σώμα, είναι δύσκολο να αναγνωριστούν στο πλαίσιο του πολύπλοκου κινούμενου ιστού του σώματος, αλλά η ικανότητά τους ανίχνευσης έχει βελτιωθεί με τη μετακίνηση του μαγνήτη οριζόντια πάνω από την τραχεία για να «κινούν» τις χορδές MP.Ενώ η απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο είναι δυνατή, είναι ευκολότερο να διακρίνει κανείς την κίνηση των σωματιδίων αφού το ζώο έχει θανατωθεί με ανθρωπισμό.Οι συγκεντρώσεις MP ήταν συνήθως υψηλότερες σε αυτή τη θέση όταν ο μαγνήτης τοποθετήθηκε πάνω από την περιοχή απεικόνισης, αν και ορισμένα σωματίδια συνήθως βρέθηκαν πιο κάτω από την τραχεία.Σε αντίθεση με τις in vitro μελέτες, τα σωματίδια δεν μπορούν να συρθούν προς τα κάτω στην τραχεία με την κίνηση ενός μαγνήτη.Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με τον τρόπο με τον οποίο η βλέννα που καλύπτει την επιφάνεια της τραχείας τυπικά επεξεργάζεται τα εισπνεόμενα σωματίδια, παγιδεύοντάς τα στη βλέννα και στη συνέχεια καθαρίζοντάς τα μέσω του μηχανισμού βλεννο-βλεννογονικής κάθαρσης.
Υποθέσαμε ότι η χρήση μαγνητών πάνω και κάτω από την τραχεία για έλξη (Εικ. 3β) θα μπορούσε να έχει ως αποτέλεσμα ένα πιο ομοιόμορφο μαγνητικό πεδίο, αντί για ένα μαγνητικό πεδίο που είναι πολύ συγκεντρωμένο σε ένα σημείο, με αποτέλεσμα πιθανώς μια πιο ομοιόμορφη κατανομή των σωματιδίων..Ωστόσο, η προκαταρκτική μας μελέτη δεν βρήκε σαφή στοιχεία που να υποστηρίζουν αυτήν την υπόθεση.Ομοίως, η ρύθμιση ενός ζεύγους μαγνητών για απώθηση (Εικ. 3γ) δεν είχε ως αποτέλεσμα την καθίζηση περισσότερων σωματιδίων στην περιοχή της εικόνας.Αυτά τα δύο ευρήματα δείχνουν ότι η ρύθμιση διπλού μαγνήτη δεν βελτιώνει σημαντικά τον τοπικό έλεγχο της κατάδειξης MP και ότι οι ισχυρές μαγνητικές δυνάμεις που προκύπτουν είναι δύσκολο να συντονιστούν, καθιστώντας αυτήν την προσέγγιση λιγότερο πρακτική.Ομοίως, ο προσανατολισμός του μαγνήτη πάνω και κατά μήκος της τραχείας (Εικόνα 3δ) δεν αύξησε επίσης τον αριθμό των σωματιδίων που απομένουν στην περιοχή που απεικονίζεται.Ορισμένες από αυτές τις εναλλακτικές διαμορφώσεις ενδέχεται να μην είναι επιτυχείς καθώς έχουν ως αποτέλεσμα μείωση της έντασης του μαγνητικού πεδίου στη ζώνη εναπόθεσης.Έτσι, η διαμόρφωση μονού μαγνήτη στις 30 μοίρες (Εικ. 3α) θεωρείται η απλούστερη και πιο αποτελεσματική μέθοδος δοκιμής in vivo.
Η μελέτη LV-MP έδειξε ότι όταν οι φορείς LV συνδυάστηκαν με CombiMag και χορηγήθηκαν μετά από φυσική διαταραχή παρουσία μαγνητικού πεδίου, τα επίπεδα μεταγωγής αυξήθηκαν σημαντικά στην τραχεία σε σύγκριση με τους μάρτυρες.Με βάση τις μελέτες απεικόνισης σύγχροτρον και τα αποτελέσματα LacZ, το μαγνητικό πεδίο φάνηκε να μπορεί να κρατά το LV στην τραχεία και να μειώνει τον αριθμό των σωματιδίων φορέα που διείσδυσαν αμέσως βαθιά στον πνεύμονα.Τέτοιες βελτιώσεις στόχευσης μπορούν να οδηγήσουν σε υψηλότερη αποτελεσματικότητα, ενώ μειώνουν τους χορηγούμενους τίτλους, τη μη στοχευμένη μεταγωγή, τις φλεγμονώδεις και ανοσολογικές παρενέργειες και το κόστος μεταφοράς γονιδίων.Είναι σημαντικό, σύμφωνα με τον κατασκευαστή, το CombiMag μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους μεταφοράς γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων άλλων ιικών φορέων (όπως AAV) και νουκλεϊκών οξέων.